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慢病毒最新娱乐体验_慢病毒包装步骤(2024年12月深度解析)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：话题更新日期：2024-12-03

慢病毒

基因调控全攻略𐟓š 在研究基因功能或验证药物靶点时，基因过表达、敲低和敲除是必不可少的步骤。很多科研人员可能对这些方法感到困惑，因此整理了一些体外细胞实验中常用的过表达、敲低和敲除方法，供大家参考。体内动物的基因编辑将在下一期讲解。基因过表达 𐟓ˆ 基因过表达是将目的基因的编码区序列（CDS）克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上的调控元件，使基因在人为控制下大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。质粒：瞬时转染普通编码基因过表达 miRNA过表达 lncRNA过表达 circRNA过表达特点：过程简单：常规质粒载体通过常规转染即可将质粒转入细胞。载体容量大：有足够大的容量放置感兴趣的序列。表达水平高：表达水平较高。表达时间短：表达时间较短。慢病毒：稳定转染慢病毒重组载体构建完成后需要辅助质粒的参与才能包装形成病毒颗粒。通过对上清液中活体病毒的直接收集或进一步浓缩病毒后可用于转染靶细胞，释放到宿主细胞中的病毒RNA逆转录成双链DNA，进一步整合到宿主细胞的基因组中。感染谱广：感染范围广泛。稳定表达：通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长期稳定表达。安全性高：安全性较高。包装容量有限：插入的外源基因需在4kb以下。包装滴度较低：包装滴度较低。基因敲低 𐟓‰ 基因敲低是利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。 siRNA：瞬时转染小干扰RNA（siRNA），是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。基因敲除 ✖️ 基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9技术是一种常用的基因编辑技术，通过在基因组中引入特定的DNA片段，实现基因的敲除。希望这些信息能帮助大家更好地理解和掌握基因过表达、敲低和敲除的方法，欢迎交流学习！

NEJM刊文：这种基因疗法会导致10%的病人患癌！肾上腺脑白质营养不良（ALD）是一种罕见的单基因遗传性脂类代谢病，该病会破坏大脑神经，并常常导致患者在 20 岁之前死亡。2022 年，美国食品和药品管理局（FDA）批准了Bluebird Bio公司的基因疗法 Skysona 。该疗法使用改造过的慢病毒载体递送治疗基因，阻止疾病进展，治疗费用高达 300 万美元。 10月9日，一项发表于《新英格兰医学杂志》（NEJM）的研究报告显示，在接受 Skysona 临床试验的 67 名患者中，6 名患者患上了一种名为骨髓增生异常综合征（MDS，该疾病可以发展为白血病）的恶性肿瘤，一名患者患上了白血病。据悉，早在 2021 年和 2022 年，Skysona 已分别导致一例和两例患者出现 MDS。而在此次患癌的 7 名患者中，6 人不得不再次接受造血干细胞移植以治疗副作用，其中 4 人的癌症已经治愈，一名患者因对移植干细胞的免疫排斥而去世。随着时间推移，患癌病例或还将继续增加。研究人员推测，患者出现癌症可能源于慢病毒载体携带的强力增强子序列激活了致癌基因；另一可能因素是化疗，因为这 7 位患癌病例中的 6 例都曾使用过氟达拉滨（fludarabine）。研究人员正在考虑重新设计可以更精准靶向患病细胞的慢病毒载体，并不再引入强力增强子。「热门微博」「科研动态」「医学进展」「药物」

[话筒]云课堂直播回顾来啦！网页链接 [赞啊]课堂主题：巧用AAV，高分文章不发愁——赛业AAV助力高分文章 [星星]为什么AAV敲低或过表达在mRNA水平上没有差异？ [星星]为什么滴度足够，但侵染细胞后荧光低？ [星星]慢病毒、HSV和AVV哪个更有发展潜力，他们的优势各是什么? 就让小助理带大家一起回顾一下本次课程的精彩问答吧！「科研超话生物医药超话」「AAV」「病毒包装」

【福利】过表达质粒/慢病毒包装/AAV定制，周年专属好价吉满生物自创立以来，一直专注于病毒包装领域。经过十三年的钻研与发展，现已创建了具有自主知识产权的分子生物学、细胞生物学、病毒包装、细胞株构建、报告基因、抗体表达、蛋白表达、IVD等技术平台。值此吉满十三周年之际，我们特别推出了一系列精彩活动，丰富的互动好礼，专属的周年优惠，特此邀请您加入我们的庆典吧！无限挑战，无限成长，无限可能吉满生物将继续以优质产品和服务回馈每一位客户的信任与支持未来，期待与您携手续写新的篇章

慢病毒感染实验全攻略 𐟓… 实验准备提前一天铺板：准备96孔板，每孔铺1万个细胞（3T3细胞长满的50%）。设置对照组LVZsGreen（简写为V-ctrl）和实验组LVOV-Becn1（简写为V-Becn1）。设置6个MOI梯度：0、10、20、50、100、200。计算用量：计算polybrene和LV的用量。Polybrene（2mg/mL）工作浓度定为2ug/mL（说明书推荐4-8ug/mL），每孔需50uL含Polybrene的CCM，共600uL。感染当天按1:1000配置700uL备用。分装后-20℃保存，使用后剩余的4℃保存2周。病毒稀释：V-ctrl稀释为1.5E8TU/mL，V-Becn1稀释为1E8TU/mL。感染当天将V-ctrl按2:1稀释为1*105TU/uL。分装后-20℃保存，使用后剩余的4℃保存1周。 𐟓… D0感染解冻材料：取出polybrene（100uL/管），冰上解冻，轻柔吹匀，分装10uL/管。取出LV（200uL/管），冰上解冻，轻柔吹匀，分装50uL/管。V-ctrl取30uL+15uLCCM，V-Becn1取45uL。配置Polybrene CCM：取0.7uL Polybrene+700uL CCM（含10%FBS）。换液：每孔加50uL Polybrene CCM。加LV：按照计算体积加入病毒液，轻晃匀。 𐟓… D2感染后24h 换液：换为CCM。 𐟓… D3感染后48h 观察细胞状态。 𐟓… D4感染后72h 拍摄荧光照片（明场+ZsGreen），计算感染效率。选择感染效率超过80%的MOI孔（记录最低MOI）。若有孔长满，则分别传代。确定最低MOI后，将大于等于此MOI的孔混合传代。 𐟓… 传代与药筛传代：将细胞传代，混合穿戴后换puro培养基药筛（工作浓度10ug/mL，赠品2mg/mL，按照1:200稀释）。药筛7天后换CCM 7天，再药筛7天，循环。扩大培养：一传二，传到大皿后，每代1大皿冻2管，另1大皿传2大皿。

我所有课题的sponsor，Vyriad公司今天宣布了和诺华公司的战略合作以加速临床转化用重靶向的慢病毒实现在体CAR-T疗法。CAR-T疗法最近又爆发了第二春，但目前还是依赖于从病人体内分离T细胞再在体外用病毒载体转化为CAR- T细胞再体外扩增最后会输病人体内。这种方法既贵又费时。而Vyriad公司的重靶向慢病毒可直接输入患者直接在体实现CAR-T疗法，具有不可比较的优势。这次输血降大大加速临床转化。对我的一个研究项目用疱疹病毒载体实现在体CAR- T疗法也有很大促进作用。 Vyriad公司致力于用病毒载体实现在体的免疫疗法、细胞疗法和基因治疗。

如何选择合适的感受态细胞？𐟤” 在实验室中，选择合适的感受态细胞至关重要，它们能够影响实验的效率和结果。以下是一些常见的感受态细胞类型及其特点，帮助你做出最佳选择： DH5a 𐟏… DH5a是实验室常用的感受态细胞，转化效率高，特别适合用于蓝白斑筛选。 T0P10 𐟌€ T0P10是常规实验用的克隆感受态细胞，生长速度快，转化效率高，同样适用于蓝白斑筛选。 JM109 𐟔슠 JM109是提取高质量DNA的理想菌株，非常适合用于构建克隆和蓝白斑筛选实验。 Stbl3 𐟌 Stbl3是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，适用于特定的实验需求。 DH10B 𐟌 DH10B能够提取高纯度DNA，特别适合克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA。 BL21 𐟒ꊠ BL21用于非毒性蛋白的高水平表达，效果显著，是超级好用的选择。选择合适的感受态细胞可以大大提高实验的效率和成功率，记得根据具体实验需求来选择哦！𐟔찟ŒŸ

MOI测定与计算全攻略，提升病毒效率！ 𐟔죀科研实验必备】MOI测定与计算全攻略 𐟌𑧻†胞培养与增殖：在科研实验中，细胞的增殖是一个动态过程，通常在细胞贴壁后不久开始。𐟧ꧻ†胞贴壁是指细胞从悬浮状态附着到培养容器表面，然后开始伸展并增殖。这个过程包括潜伏期、指数增生期和停滞期。 𐟓…确定感染时间：在计算MOI时，通常选择在细胞贴壁后的第二天进行感染。这是因为此时细胞已经附着并开始增殖，但还未达到指数增生期的高峰，从而提高感染效率。𐟒‰如果细胞在铺板后增殖过快，可能会在感染前就已经进入指数增生期的后期或停滞期，这时需要根据细胞的实际生长情况调整MOI的计算和感染时间。 𐟓ŠMOI的计算方法： MOI（感染复数）是指病毒与细胞的比值，通常用于衡量病毒感染的效率。𐟔⥜訮᧮—MOI时，需要根据实验的具体条件和细胞的实际生长情况来确定。 𐟔提高慢病毒效率的方法：通过优化MOI的计算和感染时间，可以提高慢病毒的感染效率。𐟒ᨿ™将有助于在科研实验中获得更准确和可靠的结果。 𐟌Ÿ系列预告：下一篇笔记将附上不同细胞的MOI推荐表，供大家参考。𐟓‹ 𐟔通过这些详细的步骤和技巧，你可以更好地掌握MOI的测定和计算方法，从而提高病毒感染的效率。𐟚€

等待看下潜在买家是谁。CGT 高端治疗CTDMO业务（WuXi ATU）：受美国拟议法案影响，正在评估各种选项以保持业务的持续运营，避免对患者造成影响前三季度高端治疗CTDMO业务实现收入8.5亿元，经调整non-IFRS毛利率为(29.7)%。主要由于：1) 高毛利项目于2023年度完成；商业化项目仍处于放量早期阶段。 2) 部分项目延迟或因客户原因取消；以及受美国拟议法案影响，新签订单不足。公司持续加强CTDMO服务平台建设。截至2024年9月底，为总计59个项目提供工艺开发、检测与生产服务，包括2个商业化项目，4个临床III期项目（其中1个项目处于上市申请准备阶段），8个临床II期项目，以及45个临床前和临床I期项目。其中，新增世界首个创新肿瘤淋巴细胞疗法（TIL）商业化项目。公司正在为一项商业化CAR-T产品的慢病毒载体（LVV）生产做BLA申报准备，已完成工艺验证（PPQ），同时已开始PPQ后的生产，预计将在2024年第四季度申报FDA。另外，公司助力客户进行世界首例创新体内制造CAR-T疗法的临床试验，提供从质粒到病毒的工艺开发与GMP生产全流程服务。

11/27，美国FDA已对bluebird bio的基因疗法Skysona（elivaldogene autotemcel）展开调查，该疗法于2022年获得批准，用于治疗4至17岁男孩的脑性肾上腺白质营养不良症（CALD）。调查背景此举源于上个月《新英格兰医学杂志》（NEJM）发布的一篇论文，揭示了67名接受该疗法治疗的儿童中，有7名在治疗后14至92个月之间发生了血液系统恶性肿瘤。报告指出，7名患者中有1例急性髓性白血病（AML），以及6例骨髓增生异常综合症（MDS）。这些患者参与了两项24个月的研究和一项长期随访研究。 FDA考虑采取监管行动 FDA周三表示：“FDA正在调查与Skysona治疗相关的血液系统恶性肿瘤的已知风险，这些恶性肿瘤可能导致严重后果，包括住院、需要同种异体造血干细胞移植（HSCT）和死亡，并正在评估是否需要采取进一步的监管措施。” FDA还建议：“鉴于这一风险，医疗服务提供者应谨慎考虑替代治疗方案，包括对于具有合适、愿意并可用的HLA配型捐献者的患者，考虑使用同种异体造血干细胞移植，而不是立即决定用Skysona治疗儿童。” 慢病毒载体插入与患者情况根据NEJM的论文，6名有数据的患者显示其DNA中有多个位置出现了慢病毒载体插入。5名患者的插入位点接近MECOM-EVI1基因，1名患者的插入位点接近PRDM16基因。部分患者出现了细胞减少症，大多数患者的载体插入发生在同一克隆内的多个基因中。截至今年4月，5名患者已接受同种异体HSCT治疗MDS或AML，其中4名患者存活，1名患者因移植物抗宿主病去世。 Skysona的现有风险警告与后续研究 Skysona在美国的标签中已包含关于治疗后发生血液恶性肿瘤的严重风险的黑框警告。此外，批准还要求进行为期15年的上市后安全性研究。在批准之前，Skysona已经因2021年在一项III期临床试验中出现疑似MDS病例而受到FDA临床暂停。公司面临财务挑战 bluebird bio目前面临持续的财务挑战，最近披露公司仍处于财务困境中。在第三季度财报发布时，公司表示，若无法获得额外资金，预计到2025年初将耗尽现金储备。9月，bluebird宣布将裁员约四分之一，以期将运营成本减少20%。同时，Skysona与该公司三款基因疗法（Lyfgenia [lovotibeglogene autotemcel]和Zynteglo [betibeglogene autotemcel]）一直未能获得市场认可。网页链接

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