当前位置：网站首页 » 热点 » 内容详情

wb原理最新视觉报道_wb实验的原理和步骤(2024年11月全程跟踪)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：热点更新日期：2024-11-29

wb原理

WB实验详细步骤：从零开始到结果解析蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于分子生物学和生物化学实验中。以下是详细的实验步骤，帮助你从零开始完成WB实验。 𐟧ꠥꌥŽŸ理蛋白免疫印迹技术主要由三部分组成：凝胶电泳、样品印迹和免疫学检测。 1️⃣ 凝胶电泳：首先进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。 2️⃣ 样品印迹：将凝胶中的蛋白质转移到固相支持物上，常用的材料有硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。转移方法多为电泳转移，分为半干法和湿法，现在多采用湿法。 3️⃣ 免疫学检测：用特异性的抗体检测已经印迹在膜上的相应抗原。免疫检测方法可以是直接的和间接的，现在多用间接免疫酶标法。具体步骤如下：用特异性的第一抗体杂交结合。再用酶标的第二抗体（如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合。加酶的底物显色，或者通过膜上的颜色或X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。 𐟓 实验步骤准备样品：将待测蛋白质样品进行处理，使其适合进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。进行凝胶电泳：将处理好的样品加入到凝胶中，进行电泳分离。样品印迹：将分离好的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。免疫学检测：用特异性的第一抗体和酶标的第二抗体进行杂交，最后加酶的底物显色。结果解析：观察膜上的颜色或X光底片上的曝光条带，分析实验结果。通过以上步骤，你就可以完成一次WB实验，并得到相应的蛋白质表达水平检测结果。

WB原理详解，科研新手必看！ Western blot技术，也被大家称为蛋白质免疫印迹试验，是一种非常重要的实验技术。它能帮助我们鉴定并半定量分析细胞或组织中的特定蛋白质。这项技术主要包括七个关键步骤，分别是：从样本中提取蛋白质、对提取的蛋白质进行定量、利用SDS-PAGE电泳技术分离蛋白质、通过电转印将蛋白质转移到膜上、对膜进行封闭处理、让抗原与抗体发生免疫反应，以及最后进行蛋白质的检测。大多数科研新手都会接触到WB实验，今天就为大家详细解释这些步骤的原理，帮助大家更好地理解Western blot技术的运作原理。提取蛋白质 𐟧슩斥…ˆ，我们需要从样本中提取蛋白质。这个过程通常涉及到使用一些化学试剂，如蛋白酶抑制剂和去污剂，以确保蛋白质的完整性和纯度。蛋白质定量 𐟓 接下来，我们对提取的蛋白质进行定量。这一步非常重要，因为我们需要确保每个样品中的蛋白质含量一致，以便进行准确的比较。 SDS-PAGE电泳 𐟚€ 然后，我们利用SDS-PAGE电泳技术分离蛋白质。在这个过程中，蛋白质会根据其大小和电荷在凝胶中移动，从而分离出不同的蛋白质条带。电转印 𐟔„ 接下来，通过电转印将蛋白质转移到膜上。这个过程类似于复印机的工作原理，将蛋白质从凝胶转移到膜上，以便进行后续的免疫反应。封闭处理 𐟚犥œ訆œ上进行封闭处理。这一步是为了减少非特异性结合，提高实验的准确性。封闭剂通常是一些高浓度的蛋白或非特异性抗体。免疫反应 𐟦 然后，让抗原与抗体发生免疫反应。这个过程涉及到将膜与含有特定抗体的溶液孵育，从而形成抗原-抗体复合物。检测蛋白质 𐟔 最后，进行蛋白质的检测。我们通常使用一些显色剂或荧光染料来标记抗原-抗体复合物，从而在膜上形成可见的条带。通过这些步骤，我们就能准确地鉴定并半定量分析细胞或组织中的特定蛋白质了。希望这篇详细的Western blot原理解析能帮助大家更好地理解这项重要的实验技术！

WB操作指南：轻松掌握核心原理几页笔记带你搞懂WB的核心原理和操作必要性，跟着我一起战胜西方印迹吧！（字有点丑，大家凑合着看吧）#wb

𐟧엂、ELISA、IHC全解析𐟔 𐟒‰免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）和酶联免疫吸附试验（ELISA），这三大免疫学实验技术，你了解多少？今天就来一探究竟！ 𐟔엂（免疫蛋白印迹法Western Blot），是检测蛋白质特性、表达与分布的利器。通过SDS-PAGE分离蛋白质，再利用电转仪转移到固相载体上，通过抗原-抗体-标记物显色来检测样品，定性和半定量都靠它啦！ 𐟧쉈C（免疫组化Immunohistochemistry），融合了免疫学原理和组织学技术，让抗原在组织或细胞内无处遁形。通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，定位、定性及定量都轻松搞定！ 𐟒ᅌISA（酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay），则是用到了免疫学原理和化学反应显色。与IHC不同，它主要检测血清、血浆等样品，操作简便，定量准确，是分泌性蛋白检测的首选哦！ 𐟔这三大实验技术各有千秋，WB与IHC技术相比，定量可能更加准确；而ELISA与免疫组化技术相比，定量最准确。选择哪种技术，就看你的实验需求啦！

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

2023年WB实验全攻略：从原理到操作 𐟔젥ꌥŽŸ理这个实验用到了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要是把细胞或组织里的蛋白质分离出来，然后转移到PVDF或者NC膜上。接着，用特定的抗体去和目标蛋白结合，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体进行反应。最后，通过底物显色来分析曝光条带的位置和灰度，从而知道目标蛋白在样本中的表达情况。 𐟓 实验流程样本制备：包括蛋白质提取、定量和变性。 SDS-PAGE凝胶电泳：把蛋白质分离。转膜：通过电转把蛋白质转移到PVDF、硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。封闭：用脱脂牛奶或者BSA封闭膜上的非特异性位点。一抗、二抗孵育：让抗体和蛋白质结合。 ECL化学发光检测：显影。胶片灰度分析及数据处理：用内参进行半定量分析。 𐟧ꠦ 𗦜쥈𖥤‡（贴壁细胞总蛋白提取）用TBS（Tris缓冲液）冲洗细胞三次，最后一次吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂（使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF或cocktail），在培养板内3-5分钟。反复晃动培养板，使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。冰浴30分钟，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 12000g离心5分钟，收集上清，即为总蛋白溶液。样品分装冻存于-20℃备用。 𐟓Œ 注意事项及原理为什么用TBS而不是PBS？PBS是磷酸盐缓冲液，虽然用途广泛，但容易与钙离子镁离子络合形成沉淀，还会抑制某些生物化学过程。而Tris缓冲液对生物化学过程影响很小，且不与钙离子镁离子发生作用。希望这篇攻略能帮到你，祝你实验顺利！𐟒ꀀ

WB实验流程及注意事项详解 𐟧Š 样品制备与保存在样品制备完成后，应立即将其低温保存。短期（几天）内可存放在-20℃，长期则建议使用-80℃。需要注意的是，对于IP（免疫沉淀）实验，样品应直接进行IP操作，以避免冻融破坏蛋白质间的相互作用。 𐟔⠦ 𗥓定量在样品制备过程中，定量是一个关键步骤。由于WB系统本身存在约20%的误差，因此细微的差别通常可以忽略不计。细胞样品可以先进行计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果产生太大影响。组织样品则需要从肿瘤组织的大小（称重）开始，精确控制裂解液的体积，并尽量避免蛋白损失。 𐟧ꠥ‡胶电泳 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）基本原理：凝胶由两种不同的凝胶层组成，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。小贴士：制胶过程中，确保胶面平整，凝胶速度不宜过快。点样顺序需提前设计，空的泳道需点上等体积的1X loading buffer。电泳时通常采用恒压电泳，具体电压根据仪器不同略有差异，但不宜过高。 𐟓Š 电泳条件样品间浓度差异过大、盐浓度过高、太过粘稠、有不溶的颗粒物、胶孔不齐等都会影响条带的美观。根据蛋白分子量大小选择不同浓度的分离胶，例如8%胶适用于300KDa-36KDa之间的蛋白，12%胶适用于180KDa左右的蛋白。 𐟔„ 转膜与检测转膜效率对WB结果的影响不容忽视。对于大蛋白转印，很多书籍建议采用低浓度胶，如6%SDS-PAGE。但实际操作发现，6%胶太软，制作转印三明治的操作非常麻烦，且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示55KDa左右，除非采用灌注不同浓度的胶或梯度胶，否则需要同时跑两块胶。因此，300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶同时兼顾内参和大蛋白。通过以上步骤，可以确保WB实验的顺利进行，并获得准确可靠的结果。

WB封闭全攻略：原理、步骤和注意事项大家好！今天我们来聊聊Western Blot（WB）实验中的封闭步骤，带你彻底搞懂这个基础实验环节。记得点赞关注，不迷路哦～封闭原理 𐟧슧‰駐†屏障：封闭剂通过物理作用覆盖膜上的未占据位点，形成一个屏障，阻止抗体与膜直接结合。这样，抗体就只能与目标蛋白结合了，减少非特异性结合，降低背景信号。电荷和亲水性：封闭剂的分子具有适当的电荷和亲水性，能够与膜表面相互作用，进一步增强封闭效果。这种电荷和亲水性帮助封闭剂在膜表面稳定地吸附。封闭目的 𐟎‡少非特异性结合：在WB实验中，膜表面（如PVDF或NC膜）可能会有未被蛋白质占据的结合位点。这些位点如果不被封闭，就可能与一抗或二抗非特异性结合，从而导致背景信号增加。提高信噪比：封闭过程可以有效降低非特异性信号，提高目标蛋白的可检测性，使实验结果更加清晰。信号与背景的比值（信噪比）是衡量实验成功与否的一个重要指标。保护膜表面：封闭剂可以覆盖膜表面，防止其他蛋白质或化学物质干扰信号。这对于在复杂生物样品中检测特定目标蛋白尤为重要。封闭步骤及注意事项 𐟓 膜处理：在转膜后，将PVDF或NC膜放入含有封闭剂的缓冲液中。封闭剂的浓度通常为5%至10%（如5%脱脂奶粉或BSA）。孵育：在室温下孵育1小时，或者在4Ⰳ下过夜。这一过程使封闭剂充分覆盖膜表面，确保未被占据的结合位点得到封闭。注意事项：封闭时间过短可能导致非特异性结合，封闭时间过长则可能降低信号强度。一般建议封闭时间为1小时至过夜。室温封闭适用于大多数实验，但在某些高灵敏度实验中，选择4Ⰳ孵育可能会获得更好的封闭效果。洗涤：孵育结束后，用TBST（含有Tween-20的Tris缓冲盐水）洗涤膜，通常洗涤3次，每次5-10分钟，以去除未结合的封闭剂。洗涤步骤有助于减少背景信号。注意不要过于频繁洗涤，以免目标蛋白流失。加入抗体：洗涤后，直接加入一抗（通常是针对目标蛋白的特异性抗体），继续进行WB的下一步。希望这篇攻略能帮到你，让你的WB实验更加顺利！如果有任何问题，欢迎在评论区留言哦～

WB实验中蛋白煮沸的四大原因在进行WB（Western Blot）实验时，每次上样前都需要将蛋白样品进行煮沸处理。这个步骤看似简单，但实际上却对实验结果有着至关重要的影响。那么，为什么每次上样都需要煮蛋白呢？让我们一起来探讨一下其中的原理吧！促进 SDS 与蛋白质的结合 𐟒ꊓDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质结合，使其完全变性和解聚，形成带负电荷的棒状结构。这种结构在电场中能够稳定迁移，是电泳分离的基础。然而，SDS 与蛋白质的结合并非自发进行，需要一定的条件来加速这个过程。高温处理（如煮沸）能够显著提高 SDS 与蛋白质的结合效率，确保蛋白质完全变性和解聚，便于后续蛋白质分子量大小的分离。破坏蛋白质的高级结构 𐟏—️ 蛋白质的高级结构（包括二级、三级和四级结构）是由多种非共价键（如氢键、疏水键、离子键等）维持的。这些高级结构在电泳过程中可能会干扰蛋白质的迁移，导致实验结果不准确。煮沸处理能够破坏这些非共价键，使蛋白质的高级结构解体，转变为线性结构。这样，蛋白质在电泳时的迁移率与分子量大小有关。灭活蛋白酶 𐟔动›‹白酶是一类能够水解蛋白质的酶类，它们的存在严重干扰 WB 实验结果。在样品制备和处理过程中，如果未能有效灭活蛋白酶，它们可能会降解蛋白质，导致实验结果出现偏差。煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整，不被降解。提高蛋白样品的稳定性 ⚖️ 煮沸处理不仅能够促进 SDS 与蛋白质的结合、破坏蛋白质的高级结构、灭活蛋白酶，还能够提高蛋白样品的稳定性。确保实验结果的可能性和重复性，每次上样前对蛋白样品进行煮沸处理，能够确保实验条件一致性，从而提高实验结果的可靠性和重复性。如果省略这一步骤，不同批次或不同实验者之间的实验结果可能出现较大差异。煮蛋白的具体操作步骤 𐟍𓊧…‹白的过程通常是将蛋白样品与上样缓冲液混合后，在沸水浴或PCR仪中加热至95-100Ⰳ，煮3-5分钟。加热过程中需要不断摇动或搅拌样品，以确保受热均匀。除个别蛋白样品外，如膜蛋白不宜高温，一般37℃放置10分钟，而核蛋白先配平后，不需要进行煮沸，直接离心上样。煮蛋白时间不宜过长，不然可能会导致蛋白变性，影响后续实验结果；煮蛋白温度控制在95-100Ⰳ之间为宜，常规煮蛋白时间为3-5分钟，如果样品浓度过浓时就煮10分钟。煮蛋白10分钟后，仍然吸不出来，适当增加 Buffer，继续煮，也可以对样品进行超声。若煮样的时间过长，蛋白出现凝固，建议丢了吧，没用了；煮蛋白过程中要记得混匀样本，确保样本受热均匀。通过以上几点，我们可以看出，煮蛋白在WB实验中扮演着至关重要的角色，确保了实验的准确性和可靠性。希望这篇文章能帮助你更好地理解WB实验中煮蛋白的必要性！

国自然研究方案关键技术全解析 𐟍š 米饭再美味，没有米也是白搭。同样，科研工作再精彩，没有合适的实验技术也是枉然。 𐟔 在撰写研究方案时，深入理解并掌握关键实验技术至关重要。这不仅能帮助你更好地把控研究方案，还能提升你的设计能力，让你在科研的舞台上游刃有余。 𐟌쯸 例如，你知道WB（Western Blot）实验的真正目的吗？它不仅仅是检测蛋白表达水平，还能定量计算蛋白丰度。那么，为什么还需要ELISA技术呢？因为它们各有千秋，相互补充。 𐟔砦Š€术之间是相互依赖的，没有一种技术可以完全替代另一种。因此，理解这些技术的原理、特点和实验目的，以及可能的实验结论，是创新和优化研究方案的关键。 𐟓 以下是国自然研究方案中常见的一些关键实验技术总结：检测RNA分子的空间分布和表达丰度：活细胞动态RNA成像技术、单分子RNA FISH原位杂交、多分子RNA Scope原位杂交技术、细胞核-细胞质分离结合qPCR、单细胞测序技术、空间转录组技术、Northern blot、dot blot等。检测蛋白分子的空间分布和表达丰度：免疫荧光、免疫组化、细胞核-细胞质分离结合WB、GFP标签融合蛋白示踪技术、空间蛋白质组学等。检测DNA拷贝数和突变：FISH原位杂交、qPCR、基因组测序等。检测蛋白分子总的表达量（不含空间信息）：ELISA技术（定量）、Western Blot技术（半定量，不准确）。检测蛋白分子的分子量大小（不含空间信息）：分子筛层析法、Western Blot技术、双向2D电泳、质谱分析等。检测蛋白分子的高级结构信息：蛋白结晶后冷冻电镜解析高级结构、分子对接分析等。分子表达干预技术：分子克隆操纵表达技术、病毒载体过表达或者敲减表达（shRNA、siRNA）、点突变技术、CRISPR敲除或者敲入技术、CRISPRi沉默技术、功能区分段（truncate）敲除技术、靶蛋白小分子抑制剂或者单抗抑制剂等。体内水平探索分子功能：类器官、PDX模型、裸鼠皮下成瘤、各种疾病动物模型、活体成像技术等。细胞功能探索：细胞增殖、细胞周期检测、细胞衰老、细胞干性、细胞分化、细胞凋亡、细胞焦亡、炎症风暴、迁移、侵袭能力，表面受体表达等。 𐟚€ 在选择关键技术时，务必量力而行，确保符合你所在实验室的硬件设施和技术水平。避免为了追求新颖而脱离实际，评审专家会对此提出质疑。 𐟌Ÿ 掌握这些关键技术，你的研究方案将更加全面和深入，为科研工作的成功打下坚实基础。

专栏内容推荐

270 x 249 · jpeg
免疫印迹-Western Blot 实验原理-实验流程-WB常见问题详解-南京铭研生物
素材来自:merrybio.com.cn
780 x 296 · png
WB实验原理及流程图，流程实验图
素材来自:uptbio.com

540 x 355 · png
Western Blot(WB)实验原理和步骤_Cece
素材来自:sohu.com
820 x 499 · jpeg
Western Blot蛋白免疫印迹(WB)快速实验攻略
素材来自:yeasen.com

3104 x 1417 · jpeg
Western Blot 概述 _ Western Blotting技术 _ 社区 _ 小桔灯网 _ 体外诊断新媒体 - IIVD.NET
素材来自:iivd.net

671 x 444 · png
Western Blot 实验技术全攻略 - 企业动态 - 丁香通
素材来自:biomart.cn
500 x 355 · jpeg
免疫印迹-Western Blot 实验原理-实验流程-WB常见问题详解-南京铭研生物
素材来自:merrybio.com.cn

421 x 217 · png
Western Blot进阶技巧首弹——从了解目的蛋白开始-爱必信（上海）生物科技有限公司
素材来自:absin-reagents.com
600 x 338 · jpeg
怎么做 Western blot？- MedChemExpress - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

960 x 753 · jpeg
western blot 的原理是什么？ - 知乎
素材来自:zhihu.com
600 x 356 · jpeg
【细胞生物学原创系列五】Western Blot（上） - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

510 x 513 · jpeg
Western blot - 安必奇生物
素材来自:abace-biology.com
606 x 287 · jpeg
Western blot经验大盘点，有这一篇就够了纽普生物
素材来自:novopro.cn

1575 x 985 · jpeg
WB实验原理，WB实验步骤以及结果分析，本视频为直播回放视频，每周六实验讲座，周 - 哔哩哔哩
素材来自:bilibili.com
800 x 275 · png
Western Blotting的原理和操作步骤-上海路阳生物技术有限公司
素材来自:luyoruv.com

640 x 389 · jpeg
【干货收藏】WB之成功全攻略 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com
658 x 444 · png
WB过程中需要注意的细节_化工仪器网
素材来自:chem17.com

412 x 417 · jpeg
Western Blot常见问题分析 | Affinity Biosciences LTD|亲科生物官网
素材来自:affbiotech.cn
640 x 346 · png
干货：Western blot全流程教你如何从0到1 - 哔哩哔哩
素材来自:bilibili.com