当前位置：网站首页 » 教程 » 内容详情

质粒的作用前沿信息_质粒的作用及应用(2024年12月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-12-01

质粒的作用

ABLIM1增强I丂š„多泛素化为了确定ABLIM1是否具有E3连接酶活性，进行泛素化实验，表明ABLIM1是一种新的泛素E3连接酶，376-778aa是催化活性所必需的（图1a-b）。ABLIM1有4个LIM结构域、1个卷曲螺旋结构域和1个HP结构域。对ABLIM1截断体进行Co-IP实验，只有ABLIM1 402-778aa可以与I丂›𘤺’作用（图1c）。对ABLIM1的LIM结构域突变体进行Co-IP实验，表明ABLIM1-∆LIM结构域(402-778aa)增强I丂š„多泛素化（图1d）。接下来，探索介导ABLIM1与I丂›𘤺’作用的功能域。分别对ABLIM1和I丂𜺥䱧ꁥ˜体进行Co-IP实验。在ABLIM1中，HP域是降低与I丂𛓥ˆ所必需的(图1e)。在I丂𘭯𜌩œ€要PEST、AR1、AR4和AR5来降低与ABLIM1的结合(图1f)。全文分享可查阅：【《Cell Death Differ》解读：有理有据！泛素连接酶ABLIM1促进NF-稳定，调控结直肠癌进展！】。广州基云可提供泛素质粒套装，如有泛素相关科研问题，欢迎留言探讨。

PEG揭秘：酵母转化关键酵母转化过程中，PEG（聚乙二醇）以其独特的性质扮演着重要角色。𐟌 PEG是一种高分子聚合物，其分子量对酵母转化的效果有着显著影响。通常，分子量约为3000的PEG能够最有效地促进转化。 PEG在酵母转化中的主要作用包括：在高浓度的LiAc（锂乙酰）环境中保护细胞膜，减少LiAc对细胞膜结构的损伤；同时，PEG还能促进质粒更紧密地附着在酵母细胞壁上。𐟛᯸ PEG的分子量范围广泛，从300g/mol到200000g/mol不等，不同分子量的PEG在工业、医药和化妆品等领域有着各自特定的应用。𐟏�𞋥悯𜌐EG 400、PEG 600、PEG 1000等，这些数字代表的是聚合物的平均分子量。值得注意的是，50%的PEG溶液不宜进行高压灭菌，因为高压会导致PEG分子断裂，从而影响转化效率。𐟚렦�ᮧš„处理方式是过滤除菌，以确保转化过程的顺利进行。通过这些细节，我们可以看到PEG在酵母转化中的重要作用，以及其在不同领域中的广泛应用。𐟌ˆ

质粒那些事儿，必看小技巧！拿到质粒后，首先要确保你拿到的是全序列。最保险的做法是自己测序，至少要把核心区域测了。比如说，一个一万五六千bp的质粒，测个七八千bp的核心区域，也就几百块钱。这样能确保质粒没问题，后面再用也不怕浪费时间和推倒重来。有个网友做木本植物的基因编辑，稳定转化后拿到了100多个抗性芽，但检测不到靶基因编辑。我第一反应就是质粒有问题。建议他去测个序，结果发现cas9上有单核苷酸突变，很可能导致cas9功能丧失，核酸切割能力下降，最后检测不到基因编辑事件。还有一个例子是，有个年轻老师在国外做博士后时，实验室集中力量给一个中国博士做课题，想堆大文章。做到后期发现实验结果和假说反着来，总有些地方说不通。最后确定是质粒出了问题，测序发现质粒有突变。结果前面所有跟质粒相关的实验都得推倒重来，项目进度被大大拖延。那个老师当时又要回国，签证都快到期了，真是惨不忍睹。有些质粒的部分区域没有标出来，可以去NCBI上Blast，总会找到蛛丝马迹，甚至有的会很明确地标出来具体是什么东西。我最喜欢的画质粒图谱的软件是SnapGene，这个软件的厉害之处用过的人都知道，真的非常方便。在动手做质粒相关的实验前，一定要学会如何阅读图谱。看关键区域，每一个元件的作用都要轻车熟路才能去做下一步实验。质粒上的酶切位点，尤其是常用的，都要标出来。有的酶切位点是单个切点，有的有两个甚至多个。哪怕是构建载体这种小实验，也要事先把每一步在理论上都演练一遍，弄得清清楚楚，这样成功的概率才会高，才会真的节省时间。构建载体时建议把方案给有经验的人看看，有时候人是当局者迷，旁观者清。没发现问题最好，发现了问题也可以庆幸自己多留了个心眼。

质粒构建时如何选择合适的蛋白标签？𐟤” 蛋白标签是一种在DNA体外重组技术中常用的工具，它们与目的蛋白融合表达，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。那么，在质粒构建时，我们应该如何选择合适的蛋白标签呢？以下是一些常用的蛋白标签及其应用场景： 6xHis标签 𐟐Ÿ 6xHis标签可以插入目的蛋白的C末端或N末端，主要用于重组蛋白的分离纯化。这种标签在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化时非常有用。常见的带有6XHis的载体有pET-28a(+)、pET-28b、pET-22b(+)、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pACYC-duet1等。 Flag标签蛋白 𐟚銆lag标签蛋白广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等领域。常见的带有Flag标签的载体有pESC-His、pFLAG-CMV2、pENTR4-FLAG等。 C-Myc标签 𐟦 C-Myc标签是一个含11个氨基酸的小标签，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc标签已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中，可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。常见的载体有pCMV-MYC、pcDNA3.1(+)_myc-hisA、pCMV-RFP-C-Myc、pCMV-Myc等。 eGFP/eCFP/eYFP/mCherry标签 𐟌ˆ 这些标签分别是增强型绿色荧光蛋白、增强型黄绿色荧光蛋白、增强型黄绿色荧光蛋白和单体红色荧光蛋白，具有不同的激发波长发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。常见的带有eGFP的载体有pEGFP-N1、pEGFP-C1、pcDNA3.1-EGFP、pIRES-EGFP等。 SUMO标签 𐟌€ SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。常见的带有SUMO标签的载体有pET-SUMO、pET28a-SUMO等。在选择蛋白标签时，应根据实验的具体目的和需求来决定。希望这些信息能帮助你在质粒构建时做出最佳选择！

GST-pull down实验全攻略𐟓– 今天给大家介绍一种超实用的GST-pull down实验！这可是研究蛋白质相互作用的好方法哦𐟧。 𐟑‰实验原理： GST-pull down实验利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合的蛋白质（诱饵蛋白）与谷胱甘肽亲和树脂结合，从而捕获与之相互作用的蛋白质（捕获蛋白）。下面是具体步骤𐟑‡： 𐟌Ÿ蛋白表达与纯化：将GST标签的质粒转化到大肠杆菌（如BL21感受态细胞）中。诱导表达GST融合蛋白，收集细菌。用超声破碎细菌，收集含有GST融合蛋白的细胞裂解液，然后用谷胱甘肽亲和层析纯化GST融合蛋白。 𐟌Ÿ实验设计：设计实验组和对照组，实验组用GST-诱饵蛋白，对照组用单独的GST蛋白。蛋白质量要合适，一般500的诱饵蛋白GST-A即可。 𐟌Ÿ孵育与结合：将纯化好的GST融合蛋白与谷胱甘肽珠子在4Ⰳ孵育数小时，确保充分结合。将珠子和含有潜在互作蛋白的细胞裂解液或纯化的蛋白质溶液混合，在4Ⰳ过夜孵育。 𐟌Ÿ洗涤与洗脱：用预冷的PBS或特定洗涤液洗珠子，去除未结合的蛋白质。用含有不同浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液洗脱结合的蛋白质复合物。 𐟌Ÿ检测与分析：通过Western blot或质谱（MS）分析洗脱的蛋白质，验证蛋白质之间是否有相互作用。还可以用考马斯亮蓝染色或Silver staining评估纯化蛋白的量和纯度。 𐟌Ÿ结果解读：如果实验组检测到预期的互作蛋白，而对照组没有，说明GST融合蛋白和互作蛋白之间有特异性相互作用。注意：GST-pull down实验虽然简单、快速有效，但通常还需要共免疫沉淀（Co-IP）等实验来验证细胞内蛋白质相互作用是否真实存在𐟤—。

酵母双杂交实验指南：从零开始到成功酵母双杂交系统（Yeast two hybrid，Y2H）是一种强大的工具，用于研究两种蛋白质之间的相互作用。通过将这两种蛋白质分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子的DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活域（AD）上，我们可以构建融合表达载体，从而分析它们之间的相互作用。 𐟔砩…𕦯感受态细胞的制备 1️⃣ 将-80℃保存的酵母菌株在YPDA固体培养基平板上划线，30℃培养条件下倒置培养4-7天。 2️⃣ 挑取单菌落至含3毫升YPDA液体培养液中。 3️⃣ 30℃培养，200rpm震荡培养8小时。 4️⃣ 当菌液OD值约为0.3时，转移10微升菌液到含50毫升YPDA培养液中。 5️⃣ 30℃培养，200rpm震荡培养16-20小时至OD值为0.15-0.3。 6️⃣ 700g转速5分钟室温离心收集细胞。 7️⃣ 将底部沉淀使用已预热至30℃的100毫升YPDA中重悬酵母细胞。 8️⃣ 30℃，200rpm，摇3-5小时至OD值=0.6。 9️⃣ 5分钟室温离心收集细胞。 𐟔Ÿ 将底部沉淀在30毫升无菌超纯水中重悬酵母细胞。 1️⃣1️⃣ 700g转速5分钟室温离心收集细胞。 1️⃣2️⃣ 将底部沉淀加入3毫升的1.1XTE/LiAc重悬细胞。 1️⃣3️⃣ 将重悬细胞分成2管，6000g转速室温离心30秒。 1️⃣5️⃣ 将底部沉淀加入500微升的1XTE/LiAc重悬酵母细胞，分装为100微升每管。通过以上步骤，你就可以成功制备酵母感受态细胞，为后续的酵母双杂交实验打下基础。记住，每一个步骤都要细心操作，以确保实验的成功。𐟒갟Œ𑀀

1、核酸的种类脱氧核糖核酸，简称DNA；核糖核酸，简称RNA 2、核酸的功能 ①细胞内携带遗传信息的物质。 ②在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用 3、核酸的分布真核细胞DNA主要分布在细胞核中，另外线粒体、叶绿体内也含有少量的DNA；原核生物DNA主要分布在拟核、质粒；病毒DNA分布在DNA病毒中。RNA主要分布在细胞质以及RNA病毒中 4、DNA和RNA的组成成分（如图）

D-荧光素钾盐：生物发光的秘密武器 𐟦‹ D-荧光素钾盐，化学名为D-Luciferin potassium salt，是一种在生物学和生物技术领域广泛使用的物质。它不仅是萤光素酶的底物，还能在特定条件下发出迷人的黄绿色光芒。这种物质在科研和工业应用中都有着重要的地位。 D-荧光素钾盐的基本信息 𐟓– D-荧光素钾盐是一种易溶于水的固体粉末，呈浅黄色。它在水中或其他缓冲液中的溶解度非常高，达到30 mg/mL。这种物质在4Ⰳ下可以长时间储存，但如果想要更长的保质期，建议存放在-4Ⰳ的环境中。发光原理 𐟌Ÿ D-荧光素（D-Luciferin）是荧光素酶（Luciferase）的底物，后者在ATP的作用下能够氧化D-Luciferin并发出光。这种反应在生物体内活体成像技术中有着广泛的应用。通过向细胞内导入携带荧光素酶编码基因的质粒，并注入D-荧光素，可以实时监测疾病的发展状态或药物的治疗效果。使用方法 𐟧ꊤ𝓥䖧”Ÿ物发光检测：将D-荧光素钾盐用无菌纯净水溶解，配制成30 mg/mL的储备溶液。预热组织培养基至37℃，然后将处理后的培养基与储备液混合，稀释至0.15-0.3 mg/mL的工作液浓度。去除细胞培养基，加入荧光素工作液，在37℃下孵育5-10分钟，然后进行图像分析。活体成像分析：用无菌的DPBS缓冲液（不含Mgⲫ和Caⲫ）配制15 mg/mL的D-荧光素储存液。通过水系0.2 ⵭滤器过滤除菌后，按照150 mg/kg的浓度腹腔注射到小鼠体内。注射后10-15分钟，待光信号达到最强稳定平台期后进行成像分析。注意事项 ⚠️ D-荧光素钾盐的质量和纯度对于获得可靠的结果至关重要。在实际操作中，应严格按照上述步骤进行，以确保实验的准确性。 D-荧光素钾盐不仅在生物发光检测中有着广泛的应用，还在其他领域如药物研发、疾病监测等发挥着重要作用。通过深入了解其性质和使用方法，我们可以更好地利用这种物质来推动科学研究和技术创新。

𐟧쩀‰择性培养基全解析𐟔 𐟔젩€‰择性培养基，一种能高效分离特定微生物的神奇工具。 𐟌𑠥ƒ𝦠𙦍同微生物的特殊营养需求或对化学物质的敏感度，来定制培养环境。通过加入特定的营养物质或化学物质，它能有效抑制杂菌生长，同时促进目标微生物的繁衍。 𐟒ᠤ𞋥悯𜌥ˆ駔褻姺䧻𔧴 为唯一碳源的培养基，我们可以从复杂的微生物群体中筛选出能分解纤维素的微生物。而缺乏氮源的培养基，则有助于我们发现固氮微生物。 𐟧ꠥ楤–，通过在培养基中加入特定化学物质，如酚、亚硫酸铋或各种染料，我们可以更精确地分离出特定种类的微生物。这些化学物质对目标微生物无害，但能有效抑制或杀死其他微生物。 𐟔젥œ觎𐤻㥟𚥛 工程中，选择培养基更是发挥了巨大作用。通过利用质粒上的抗生素抗性选择标记，我们可以在培养基中加入相应的抗生素，从而轻松淘汰非重组菌株，大大减少了筛选目标菌株的工作量。 ✨ 选择性培养基，以其高效、精准的特性，已成为科研领域不可或缺的重要工具。

BIFC实验必备！常用载体推荐与使用指南 𐟔젥Œ分子荧光互补（BIFC）技术是一种直观、快速检测蛋白质在细胞内相互作用的方法。它利用荧光蛋白的两个片段在特定条件下重新组装并发光，从而揭示蛋白质之间的相互作用。BIFC实验的关键在于构建含有荧光蛋白片段的载体，这些片段在正常情况下不会自发结合，而是需要借助与之融合的蛋白质之间的相互作用来接近并形成完整的荧光蛋白。 𐟔頨祅‰蛋白片段的构建：荧光蛋白被切割成两个片段，分别称为N片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。这些片段在细胞内共表达或体外混合时，不会自发靠近，需要借助与它们融合的蛋白质之间的相互作用，才能在空间上相互靠近并互补。 𐟓š 常用的BIFC载体种类：哺乳动物表达体系： pBiFC-VC155与pBiFC-VN173质粒常配套使用； pBiFC-VN155(I152L)； pBiFC-bFosVC155。植物表达体系： pCE-BiFC-VN173和pCE-BiFC-VC155； pSPYCE(M)和pSPYNE173； pCCFP-X和pX-CCFP； pX-NYFP和pNYFP-X。 𐟤” 你还知道哪些常用的BIFC载体呢？欢迎分享！