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emsa实验权威发布_emsa实验结果图怎么看(2024年12月精准访谈)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：观点更新日期：2024-12-02

emsa实验

EMSA实验：GST/His-a融合蛋白的表达 GST/His-a融合蛋白的表达 (1)将目的蛋白与GST/His的重组质粒转化到BL21菌株中； (2)挑取单克隆到含有5 ml LB培养基（加入5 氨苄）的10 ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜； (3)将培养菌液转移到含有500 ml LB（含500 氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200 rpm培养数小时； (4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm条件下培养10-16 h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）； (5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50 ml离心管中，4℃ 4000 rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中； (6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10 min后弃去上清，再按每10 ml菌液沉淀1 ml PBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中； (7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20 s，间隔30 s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清； (8)将超声后的溶液4℃ 4000 rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。凝胶迁移（ EMSA ）实验技术方法步骤已分享，如有相关科研问题，欢迎留言探讨。 #研究生日常#⠂ #EMSA#⠂ #凝胶迁移实验#⠂ #蛋白表达#⠂ #实验外包#

EMSA实验数据分析与注意事项全解析在进行EMSA实验时，数据分析是关键的一步。通常，我们可以从两个方面来分析数据：底部的自由探针和上方的迁移条带（蛋白-DNA复合物）。当蛋白与DNA发生相互作用时，底部的自由探针会减少，而迁移条带的亮度则会增强。 𐟓Š 数据分析在加入等量标记探针的前提下，如果增加未标记的野生型探针，它会与标记探针竞争蛋白，导致自由探针条带强度基本不变，而迁移条带亮度减弱。相反，如果增加未标记的突变探针，由于蛋白不结合该序列，突变探针不与标记探针竞争，因此自由探针减少，迁移条带亮度增强。 𐟔 注意事项探针长度：合成的探针长度在40–60bp左右，这样有利于非结合探针和蛋白-DNA复合体的分离。探针保存：标记好的探针若不立即使用，可以保存于–30 Ⰳ冰箱中，再次使用时于冰上融化即可。实验条件优化：由于不同转录因子与DNA之间结合的强度不同，在试验中要对重组蛋白用量、探针浓度以及缓冲液配方等因素进行摸索，以确定最佳实验体系。尼龙膜处理：紫外交联后的尼龙膜可在室温条件下放置数天，注意在封闭之前勿再次吸湿。器具清洁：在操作过程中确保所用器具洁净，避免SDS或其它杂质污染。通过以上步骤，你可以更准确地分析EMSA实验数据，从而得出更可靠的结论。

𐟧쎆-KB p65活性检测大揭秘𐟔 𐟔즠𘨽쥽•因子NF-kappaB（NF-kB）可是个大家伙，它参与调控炎症、抗凋亡、肿瘤形成等好多重要过程呢！其中，p65(RelA)这个亚基可是个关键角色。 𐟒᤽ 知道吗？p65和其他几个亚基，比如p50、p49（也被称为p52）、p75（c-Rel）和p68（RelB），一起构成了NF-kB的大家庭。它们有的起反式激活作用，有的则具有DNA结合活力。 𐟔检测NF-KB p65的活性，其实就是要看看这个亚基是否在细胞核中活跃地与DNA结合。我们可以通过一系列复杂的实验，比如凝胶迁移实验，来观察这一过程。 𐟒‰在凝胶迁移实验中，我们会用到纯化的蛋白或者细胞核抽提物，然后在特定的条件下，让NF-kB与DNA结合。如果p65活性高，那么就会形成特定的凝胶迁移复合物，我们就可以通过电泳和染色来检测到它。 𐟓Š最后，我们还可以利用不同形式的NF-KB p65抗体，来捕获细胞核蛋白并加以区分。通过酶标仪450nm处的吸光度值测定，我们可以定量比较目的蛋白的活化度，从而得出一个明确的结论。 𐟎‰这样，我们就可以轻松地检测出NF-KB p65的活性啦！是不是感觉很有趣呢？快来试试吧！

如何快速发表文章？研究生必看！ ✅ 一入研究生的大门，就赶紧去实验室吧！早点上手，培养细胞、提取质粒、跑电泳、做Western，练好基本功，了解导师的研究方向，选择你感兴趣的小方向。就像“熟读唐诗300首，不会做诗也会吟”，趁着有空，赶紧看文献吧。 ✅ 实验平台非常重要，重要的事情说三遍！好的实验平台是什么？有水平的导师和良好的科研氛围，有好的动物实验室，有大量的基础实验工具，有先进的实验方法以及一脉相传的实验经验，当然齐全的仪器设备也不能少。好的实验室能帮你节省大量时间，让你有更多时间去创新。在你实验遇到问题时，有水平的导师能及时帮你找到失败原因。比如你想验证NFKB的活性，实验室有NFKB相关质粒，师兄师姐有做EMSA的经验，实验分分钟搞定，结果还特漂亮。若没有，你得写邮件求质粒或自己构建，费时费力。那么你选对平台了吗？ ✅ 开始实验时不要把鸡蛋放在一个篮筐里，研究两个小方向，两手都要硬，根据研究进展再调整侧重。 ✅ 奋斗！奋斗！奋斗！要想尽快出文章，8小时工作制就是奢侈品！ ✅ 青年研究学者（有基金，但有大量教学、医疗工作）没时间、没学生怎么办？生物公司现在如雨后春笋，既然当小Boss了，有些东西就花钱吧，如包装病毒，雇人做些基础实验，外包实验（不过要找个靠谱的，现在审计严格着呢！）。

互作机制研究方案 CoIP-Mass⠠⠠⠠⠠（ IgG-IP vs Ab-IP ） CoIP-WB⠠⠠⠠⠠⠠⠯𜈠1个候选蛋白检测） Pulldown-Mass⠠⠯𜈠对照和目的蛋白） Pulldown-WB⠠⠠⠯𜈠1个候选蛋白检测） HuProt蛋白组芯片检测⠠⠠⠯𜈠20K+蛋白互作检测） RIP-seq⠠⠠⠠⠯𜈠Input vs Ab-IP ） RIP-qPCR⠠⠯𜈠1个候选RNA检测） ChIP-Seq⠠⠠⠯𜈠Input vs Ab-IP ） ChIP-qPCR⠠（ 1个候选DNA检测） EMSA⠠⠠⠠⠠⠠⠯𜈠蛋白和DNA检测） ChIRP-Mass （ Target vs LacZ Probe ） ChIRP-Seq⠠⠯𜈠Target vs LacZ Probe ）以上如有相关问题，欢迎来询。 #科研#⠣实验外包#⠣研究生#

DAP-seq常见问题解答，一文搞定！ 1. 𐟔 DAP-seq技术原理与流程技术原理：DAP-seq通过体外表达蛋白与DNA进行亲和纯化，洗脱后进行高通量测序，从而找到转录因子的结合位点。技术流程：构建含有亲和标签的载体，体外表达转录因子与亲和标签的融合蛋白，提取基因组DNA并构建DNA文库。将体外表达的转录因子与DNA文库结合，洗脱后上机测序。解决的问题：快速定位转录因子的结合位点，发现转录因子调控的靶基因。 𐟓š 所需材料组织材料或提取好的基因组DNA 目标蛋白质粒（含有完整目标蛋白序列的质粒，如转录因子） 𐟓ˆ 实验成功率不同转录因子家族的成功率有所不同，具体成功率可参考相关资料。 𐟔„ 重复次数实验包含两个技术重复，以确保结果的可靠性。 𐟌𑠦䍧‰駻„织样本要求植物组织样本的取样时期和部位根据研究需求确定，不同组织和时期DNA的修饰可能影响蛋白与DNA的结合。 𐟔전AP-seq与ChIP-seq的区别 DAP-seq不需要针对每个转录因子制备特异性抗体，具有快速、高通量和节约时间成本的优势。 𐟓Š Input对照 Input对照用于降低背景噪音，是亲和纯化前的文库。 𐟓Œ Peak数目少的结果可用吗？虽然DAP-seq的peak数目较少，但建议仍然对现有结果进行分析，可能挖掘出亮点结果。 𐟔젩ꌨAP-seq结果 DAP-seq结果一般需要验证，验证手段包括EMSA、酵母单杂等实验。如果通过前期大量转录因子筛选出候选转录因子，也可以考虑体内ChIP等验证。

WB实验必备试剂大揭秘𐟔 在WB实验中，各种试剂扮演着至关重要的角色。你是否也对这些试剂的作用感到困惑？今天我们就来详细解析一下这些试剂的功能𐟑‡𐟑‡𐟑‡ 1⃣ SDS SDS，即十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂、洗涤剂和乳化剂。蛋白质的三维结构复杂且带有不同电荷，这会影响其在凝胶中的电泳迁移速率。SDS的作用是使蛋白样本变性，结合在蛋白表面并使其带上负电荷，从而只根据分子量大小产生不同的迁移速度，最终使大小不同的蛋白分开。 2⃣ 巯基乙醇 巯基乙醇是一种还原剂，外观为无色的透明液体，闻起来有强烈的刺激性气味，且对人体有刺激性。在WB实验中，它可以打开蛋白里半胱氨酸残基之间的二硫键，切割二硫键可以破坏蛋白的二级结构，使得蛋白样本在电泳过程不受二级结构的影响。 3⃣ 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是一种聚合物，由丙烯酰胺单体和交联剂组成。通过改变单体和交联剂的比例以及聚合条件，可以调节聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小和分辨率范围。浓度越高，形成的孔径越小，更易于分辨小分子。在Western blot实验中，不同分子量的蛋白质在凝胶中迁移速率不同，分子量较小的蛋白质迁移速率快，而分子量较大的蛋白质迁移速率慢，因此可以通过电泳分开不同大小的蛋白。 4⃣ 吐温20 吐温20是一种非离子型去垢剂，通常是黄色或琥珀色澄明的油状液体，非常粘稠。在WB实验中，通常会在封闭液或抗体洗涤液中加入吐温20，起到封闭的非特异性的作用。 5⃣ TEMED TEMED中文名称是四甲基乙二胺，是一种促凝剂。在配置SDS聚丙烯酰胺凝胶时，与过硫酸铵 (APS)一起使用，促进凝胶凝固。但是TEMED有神经毒性，应该在通风橱操作。 6⃣ Tris HCl Tris HCl是一种常见的缓冲液，在WB实验中，电泳液及制胶都需要用到Tris HCl，主要作用是维持稳定的pH值。通过了解这些试剂的作用，你可以更好地理解和掌握WB实验的原理和技巧。

琼脂糖 𐟌🠦œ€近在实验室里经常用到一种叫琼脂糖的东西，感觉它真的是个宝藏！今天就来和大家聊聊这个神奇的小东西吧。 𐟌𘠧𜨄‚糖的基本特征琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线性大聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖通过1,4和1,3连接交替形成重复双糖单位。这个结构让琼脂糖成为了不带电荷的中性组成部分。琼脂糖是透明的，不带紫外吸收，所以常用于实验室的电泳和层析技术中。它的熔化温度一般在62-90摄氏度，而凝固温度在40-42摄氏度。 𐟔젧𜨄‚糖在科研中的应用琼脂糖在科研中的应用非常广泛，尤其是在细菌固体培养基的制备以及DNA分子的回收方面。低熔点琼脂糖（如经羟乙基修饰的琼脂糖）可以将熔化温度降至40-45摄氏度，这样可以在较低温度下快速回收DNA。普通琼脂糖的熔化温度在85-90摄氏度，而低熔点的则更适合快速回收实验。另外，琼脂糖凝胶电泳也是实验室里的常客。它可以对染色体DNA进行原位酶切，方便快速地回收DNA片段。操作也很简单：将样品与含有溴酚蓝的loading buffer混合，然后将混合液加入样品孔中，设置电压至4-5V/cm，电泳35分钟即可。结束后，通过观察条带的迁移情况来评估实验结果。 𐟓 琼脂糖凝胶电泳实验步骤 1. 配胶：根据DNA片段的大小确定琼脂糖凝胶的浓度，称取适量的琼脂糖粉末于缓冲液中溶解，微波加热1分钟后加入Gelred染料，摇晃均匀后倒入模具。 2. 凝胶浇注：选择所需尺寸的凝胶浇注模具和梳齿，将加了染料的琼脂糖凝胶溶液倒入模具中，观察有无气泡产生。如果气泡过多，可以在胶未完全凝固时戳破。 3. 将样品与DNA loading buffer混合：取适量的样品与含有溴酚蓝的loading buffer混合，用来观察样品的位置。 4. 凝胶装入：待胶变硬后，将胶块放入电泳槽中，确保孔位于负电极，将运行缓冲液注入槽中。 5. 电泳：设置电压至4-5V/cm，调节电压至120V，电泳35分钟即可。结束后通过观察条带的迁移情况来评估实验结果。 𐟒ᠧ𜨄‚糖凝胶电泳的小技巧在配胶时，可以根据需要调整凝胶的浓度。通常，DNA片段越小，需要越高浓度的凝胶。此外，低熔点琼脂糖的应用也是一个小技巧。它可以降低熔化温度，使DNA在较低温度下保持稳定，方便回收。上样时，要确保样品与loading buffer充分混合，并且小心地将样品加入样品孔中，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。在电泳过程中，可以通过观察溴酚蓝的位置来判断样品的迁移情况。电泳结束后，在紫外灯下拍照并观察结果。 𐟓栧𜨄‚糖的保存和使用注意事项琼脂糖需要常温运输及保存，不需要特别复杂的保存条件。不过要注意防止微生物污染，尽量在无菌环境下操作。使用时也要确保凝胶完全凝固后再进行后续操作。以上就是关于琼脂糖的详细介绍啦！希望这些信息对大家有所帮助！有什么问题或者想了解的内容，欢迎在评论区留言哦！𐟘Š

琼脂糖凝胶电泳实验全攻略，轻松上手！ ### 一、电泳原理电泳实验的基础是电泳效应和分子筛效应。电泳效应 𐟌 在电场中，DNA、RNA和蛋白质等生物分子会根据其电荷性质移动。由于DNA和RNA分子带有负电荷，它们会向正极迁移。这个特性是电泳实验中分离和分析生物大分子的关键。分子筛效应 𐟕𓯸 琼脂糖凝胶具有网络结构，类似分子筛。较小的分子可以更容易地穿过凝胶孔隙，而较大的分子则会受到更多的阻力，因此移动得更慢。这种效应使得不同大小的分子在凝胶中以不同的速度迁移，从而实现有效的分离。二、制备琼脂糖凝胶称量琼脂糖粉末 𐟧ꊠ 根据实验需要，称取适量的琼脂糖粉末。琼脂糖的浓度通常在0.7%到2%之间，所以根据实验要求选择适宜的浓度。例如，制备0.8%凝胶时，需将0.8克琼脂糖溶解在100毫升的缓冲液中。溶解琼脂糖 𐟔加将称量好的琼脂糖粉末置于锥形瓶或适用于微波炉的烧瓶或烧杯中。然后加入适量的电泳缓冲液，例如TAE或TBE缓冲液。为了弥补沸腾过程中液体挥发的缺失，缓冲液的体积通常要比计算所需的溶液体积稍多一些。采用微波炉加热的方法，每次加热15-20秒直至液体沸腾。取出后摇匀，直到小气泡消失。重复这个过程，一般需要进行3-4次，直到琼脂糖完全溶解且液体呈完全澄清状态，不再能看见未溶解的琼脂糖颗粒。冷却和加入染料 ❄️ 待琼脂糖溶液冷却至约50-60℃时，在此温度范围内加入核酸染料，例如溴化乙锭（需注意其有毒性，目前市面上也提供了安全的核酸染料可供选择），以便在电泳后观察DNA条带。染料的浓度通常为万分之二（10000㗯𜉣€‚ 倒胶和插梳子 𐟗‚️ 将调制好的琼脂糖溶液倒入预备好的制胶模具中，确保模具水平放置。随后插入梳子以形成样品孔，选择梳子的齿数和大小应根据样品数量和体积而定（需小心确保梳子不会穿破凝胶）。凝胶冷却和固化 ❄️ 让填充好样品的琼脂糖凝胶在室温下自然冷却和固化，通常需要约30分钟。当凝胶完全固化后，小心地将梳子取出，以避免损坏样品孔。通过以上步骤，你就能成功制备出琼脂糖凝胶，为后续的电泳实验打下基础啦！𐟎‰

细胞迁移与侵袭实验全攻略 𐟔젥ꌧ›„ 通过 Transwell 小室实验，研究细胞的迁移与侵袭能力，以及不同因素对细胞该行为的影响。 𐟓– 实验原理细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中，小室内为上室，培养板内为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可影响上室内的细胞。通过使用不同孔径和处理的聚碳酸酯膜，可进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等研究。 𐟧ꠥꌦ料可拍照显微镜 Transwell 小室（孔径 8） 24 孔板 BD 公司的 Matrigel 无血清 DMEM 含 1% 胎牛血清的 DMEM 和 1640 培养基 DMEM 完全培养基 1640 完全培养基（也可加到 20% 血清）无菌 PBS，棉签，胰酶，4% 多聚甲醛固定液或甲醇结晶紫染液（0.1% (g/ml) PBS 结晶紫） 𐟓 实验步骤基质胶铺板：用 BD 公司的 Matrigel 按 1:8 稀释，包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃ 30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。制备细胞悬液：让细胞撤血清饥饿 12 - 24h，去除血清影响（非必须步骤）。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1 - 2 遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬，调整细胞密度至 5㗱0⁵/ml。接种细胞：取细胞悬液 100 加入 Transwell 小室。在 24 孔板下室加入 600 含 20% 血清的培养基，注意避免产生气泡。常规培养 12 - 48h（依癌细胞侵袭能力而定，24h 较常见）。结果统计：取出 Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的 PBS 洗 2 遍，甲醇固定 30 分钟，将小室适当风干。用 0.1% 结晶紫染色 20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用 PBS 洗 3 遍。在 400 倍显微镜下随机五个视野观察细胞，记数。 𐟓Š 实验结果记录显微镜下观察到的细胞迁移与侵袭的数量及分布情况。 𐟒젥ꌨ分析实验结果，探讨细胞迁移与侵袭能力的变化原因，以及实验过程中可能存在的误差和影响因素。

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