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HEK293权威发布_hek293t细胞简介(2024年11月精准访谈)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：观点更新日期：2024-11-28

HEK293

重组蛋白两大细胞系起底，CHO与HEK293哪家强？「科研」「实验室」「重组蛋白」

YAP和TEAD1直接被AARS1乳酸化，被SIRT1去乙酰化第一步，AARS1分别乳酸化YAP和TEADK90和K108位点乳酸化蛋白质组学KEGG分析富集多种通路，重点集中在Hippo信号通路上，YAP和TEAD1分别在K90和K108位点发生了乳酸化（图1a-b）。IP-WB检测也显示YAP-TEAD发生乳酸化（图1c）。此外，构建YAP K90R和TEAD1 K108R突变体进行IP-WB检测显示没有发生乳酸化（图1d）。另外，葡萄糖剥夺降低YAP-TEAD1的乳酸化水平，而乳酸处理明显恢复其的乳酸化水平（图1e-f）。第二步，AARS1与YAP-TEAD1相互作用 Co-IP实验发现AARS1与YAP-TEAD1互作（图1g），细胞分离实验表明主要发生在细胞核内（图1h）。GST pulldown实验也显示AARS1和YAP-TEAD1直接互作（图1i-j）。体外乳酸化实验表明，AARS1能够直接使WT TEAD1乳酸化（图1k），但不能使其K108R突变体乳酸化（图1l）。在HEK293FT细胞中，过表达WT AARS1而非其5M突变体促进了YAP-TEAD1的乳酸化(图1m)，而敲低AARS1则显著降低了YAP-TEAD1的乳酸化水平(图1n)。表明AARS1与YAP-TEAD1相互作用，并使其乳酸化修饰。第三步，YAP和TEAD直接被SIRT1去乙酰化探索可能导致YAP去乙酰化的酶。Sirtuin（去乙酰化酶）抑制剂烟酰胺(NAM)处理细胞，显著增加了YAP的乳酸化（图2a）。对sirtuin去乙酰化酶家族成员(SIRT1-SIRT7)进行筛选，发现SIRT1的过表达显著降低了YAP的乳酸化水平（图2b）。同时，Co-IP实验显示SIRT1与YAP相互作用（图2c）。构建SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y)，Co-IP实验发现SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y)未能降低细胞中YAP的乳酸化水平（图2d）。表明SIRT1使YAP和TEAD去乙酰化，导致YAP和TEAD乳酸化水平增加。全文分享可查阅：【《JCI》解读：肿瘤乳酸化修饰与泛素化修饰对抗！丙烯酰tRNA合成酶AARS1乳酸化修饰YAP复合体促进信号传导】。 #科研#⠂ #coip实验#⠂ #wb实验#⠂ #GST pulldown

六种重组蛋白表达系统重组蛋白表达系统是指利用基因工程技术将外源基因导入到合适的宿主细胞中，并通过宿主细胞的转录和翻译机制生产出具有特定生物学活性的蛋白质的系统。目前，常见的重组蛋白表达系统主要包括以下六种：一、原核表达系统 1.主要特点：发展完善、流程简单快速、成本低、产量高。适宜于表达原核来源的以及不需要翻译后修饰的真核蛋白。 2.代表宿主：大肠杆菌（E. coli）：最常用的原核表达宿主，具有遗传背景清楚、生产时间短、易于放大生产等优点。大肠杆菌表达系统基于T7 RNA聚合酶及其强启动子之间的特异性和转录的高效性，如pET系统。二、酵母表达系统 1.主要特点：真核表达系统，能对多数蛋白进行翻译后修饰，制备的蛋白更接近于天然蛋白。经济高效，适用于大规模生产。 2.代表宿主：毕赤酵母（Pichia pastoris）：一种常用的酵母表达系统，通过甲醇诱导表达外源蛋白，表达量高且稳定。三、昆虫细胞表达系统 1.主要特点：真核表达系统，能够容纳较大的外源片段插入。表达的蛋白具有完整的生物学功能，适用于生产复杂的蛋白质。 2.代表宿主：利用昆虫杆状病毒作为载体，在昆虫细胞中表达外源蛋白。四、哺乳动物细胞表达系统 1.主要特点：能够表达天然结构完整、生物活性接近于天然蛋白质的重组蛋白。适用于需要复杂翻译后修饰和高级糖基化的蛋白质生产。 2.代表宿主： CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞，是生物制药领域广泛应用的哺乳动物细胞表达系统。 HEK293细胞：人胚胎肾细胞，也常用于重组蛋白的生产。五、转基因植物表达系统 1.主要特点：利用转基因技术将外源基因导入植物细胞，通过植物组织培养技术生产重组蛋白。成本低、产量大，适用于生产食品、饲料添加剂等。 2.代表宿主：玉米、烟草、水稻等植物。六、转基因动物表达系统 1.主要特点：通过转基因技术将外源基因整合到动物基因组中，实现外源蛋白在动物体内持续表达。适用于生产大分子、复杂结构的重组蛋白，如血液制品、酶制剂等。 2.代表宿主：转基因小鼠、转基因羊等。#广州华韵生物科技有限公司#

细胞传代培养全攻略：从基础到实践细胞传代培养是细胞生物学实验的基础，当细胞在培养瓶中达到一定密度时，需要通过传代来继续生长。这个过程涉及到一系列的步骤和注意事项，确保实验的顺利进行。 𐟧젦料准备培养瓶/皿离心管移液管移液器废液缸 75%酒精所需培养细胞 𐟒Š 药品准备 DMEM培养基小牛血清或胎牛血清 0.25%胰蛋白酶 PBS缓冲液青链霉素双抗 𐟔젤𛪥™襇†备 CO₂培养箱显微镜超净台 𐟓 实验步骤从培养箱中取出细胞，镜下观察细胞状态，判断是否达到传代密度。回到超净台，吸去培养基，加入2ml左右的PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸去PBS，加入0.25%胰酶，继续晃动培养瓶使胰酶浸润所有细胞。将培养瓶放入37℃培养箱，开始消化并计时，消化时间根据细胞特性有所不同，例如HEK-293T细胞的消化时间为2分钟。用含10%血清的DMEM培养基终止消化，通过反复吹打使细胞脱离培养皿底部，尽量呈单颗细胞的悬浮液。收集细胞悬液离心，室温下1200rpm，5分钟（不同细胞离心参数设置不同），离心后吸出上清丢弃。在新的培养皿中加入新鲜培养基，用新鲜培养基将细胞重悬，吹打几下混匀细胞，将细胞接种到新培养皿，摇晃混匀。将培养皿放入培养箱。 𐟓 注意事项无菌操作规范：实验开始前和结束后，需要将超净台紫外照射灭菌30分钟，实验过程中要穿好灭菌服，戴好灭菌手套和口罩。所有物品从外面移入超净台都需要喷洒75%酒精消毒，并且同样用75%酒精消毒双手。使用胰酶消化细胞要把握好时间，切勿消化过度，及时终止消化。如果消化不够充分，可以轻拍培养皿帮助细胞脱落。弃上清的动作需一次完成，切忌抬起管口，让液体流回底部后，又再次倾倒。回流的液体会把细胞团块冲散甚至冲起来，再倾倒有把细胞团块倒掉的风险。养成在培养皿上做标记的习惯，注明传代时间，细胞种类。通过以上步骤和注意事项，可以确保细胞传代培养的顺利进行，为后续实验提供充足的细胞资源。

胶原蛋白包被培养皿的详细步骤𐟧늓igma-Aldrich推荐的胶原蛋白包被培养皿步骤胶原蛋白储存液的制备将0.1%（w/v）的胶原蛋白溶解在0.1M醋酸中。具体步骤如下： 0.1M醋酸溶液：V=1000mL=5.720ml醋酸+994.280ml ddH2O V=100mL=0.572ml醋酸+99.400ml ddH2O V=10ml=0.06ml醋酸+9.94ml ddH2O（60ul+9940ul）将胶原蛋白粉末（1mg/ml）溶解在醋酸中，具体操作如下： V=100ml=0.1g胶原蛋白+100ml 0.1M醋酸 V=10ml=0.01g胶原蛋白+10ml 0.1M醋酸将上层胶原蛋白溶液转移到无菌容器中（无菌操作，50ml离心管分装），4℃保存。注意：如果使用滤膜过滤除菌，会导致蛋白量损失。工作液的制备蛋白工作液（200ug/ml，5倍稀释）=1ml存储液（1mg/ml）+4ml ddH2O 包被步骤根据包被面积计算所需包被液体体积，以6-10ug/cmⲦ𕓥𚦥‘细胞培养皿中加入胶原蛋白工作液，完全覆盖表面即可。以T-25培养瓶为例（工作液加入1ml）：所需胶原蛋白总量=25cmⲪ(6-10)ug/cmⲽ(150-250)ug 所需胶原蛋白体积=(150-250)ug/ 1000ug/ml=(0.15-0.25)ml 干燥包被好的培养皿表面可以经过UV照射过夜灭菌。清洗步骤在接种细胞前，可用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞皿表面3次，用培养基洗涤1次。适用范围 I型胶原包被的培养皿可应用于细胞的贴壁、粘附与伸展；HEK-293；HepG2细胞培养等。

传代之后每个视野里都会看到图1那样的黑点放大之后是后面的几张图想知道这种会不会是真菌污染还是别的什么原因导致的

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