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免疫磁珠最新视觉报道_免疫磁珠是什么意思(2024年11月全程跟踪)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：热点更新日期：2024-11-26

免疫磁珠

免疫沉淀实验常见问题及解决方案𐟧ꊥ…疫沉淀(IP)是一种用于纯化和富集目标蛋白的技术，在蛋白质组学研究中常用于识别蛋白质与蛋白质之间的相互作用。以下是免疫沉淀实验中常见的一些问题及其解决方案，希望对大家的实验有所帮助。 𐟌Ÿ背景高样本中有不溶蛋白残留：离心后应立即取出上清。洗涤不充分：优化洗涤缓冲液，通过加入去垢剂（如0.5-1% NP-40/Triton X-100/Tween-20）或增加盐离子浓度（如250mM NaCl/1-2mM DTT/ME），增加洗涤时间和次数来提高洗杂效率。非特异蛋白与磁珠结合：磁珠用BSA预封闭不充分，确保BSA新鲜，将磁珠和1% BSA孵育1小时，使用前PBS洗涤3-4次。抗体特异性不好：使用亲和纯化的抗体。抗体用量太多：尝试使用更少的抗体。裂解液中蛋白含量太高：减少样本用量。蛋白和抗体非特异结合：在免疫沉淀之前预先将磁珠和样本孵育，清理样本中可以和磁珠结合的成分，一些研究人员也使用同型对照来预清理裂解液。 𐟌Ÿ没有检测到目的蛋白洗脱样本中目的蛋白不表达或低水平表达：如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。抗体用量不够：检查抗体用量，提高使用量。目标蛋白没有从磁珠上洗脱：需要确保使用的洗脱缓冲液正确。抗体没有结合磁珠：确保使用的磁珠和抗体亚型匹配，磁珠正确保存，防止变质或干燥。裂解液中盐碱度太高：改用低盐碱度裂解液，一般可选NP-40, RIPA, western及IP细胞裂解液。 𐟌Ÿ加样顺序对靶蛋白得率的影响磁珠、抗体、抗原样本混合一起孵育：速度最快，但靶蛋白纯度和得率会很低。间接法：抗体和抗原样本先结合，再加入磁珠孵育，靶蛋白得率最高。直接法：磁珠先和抗体结合，再加入抗原孵育，对于表达丰度高的蛋白，两种方法差别不大，如果表达丰度低，要选择间接法获得更高的靶蛋白得率。希望这些小知识能帮助你更好地进行免疫沉淀实验！𐟧ꀀ

在科学和生物技术领域，特别是在免疫学和分子生物学中，“包被”（coating）通常指的是将某种分子（如抗体、抗原、酶等）固定在固体表面上，例如ELISA板、磁珠或其他载体上。在这种情况下，使用“immobilize”是合适的，因为这个词确实表示将分子固定在某个位置，使其不能自由移动。例子•中文: 将抗体包被在ELISA板上。•英文: Immobilize the antibody on the ELISA plate.具体应用1. ELISA (酶联免疫吸附测定):•中文: 将捕获抗体包被在96孔板上。•英文: Immobilize the capture antibody on the 96-well plate.2. 免疫磁珠:•中文: 将特定抗体包被在磁珠表面。•英文: Immobilize specific antibodies on the surface of magnetic beads.3. 传感器:•中文: 将酶包被在传感器表面。•英文: Immobilize the enzyme on the sensor surface.详细解释•Immobilization: 这个词在生物技术和分析化学中非常常见，指的是将生物分子或化学物质固定在固体表面上，以便进行后续的实验操作。这种固定可以是通过物理吸附、共价键合或其他化学方法实现的。其他相关术语•Coating: 通常指将某种物质涂覆在表面上，这个词也可以用于描述包被过程。•Binding: 指分子之间的结合，但不一定意味着固定在固体表面上。•Conjugation: 通常指通过化学反应将两个分子连接在一起，形成一个复合物。总结在科学文献和技术文档中，使用“immobilize”来描述将分子固定在固体表面上是完全合适的。这个词准确地传达了分子被固定并无法自由移动的意思。

光亲和磁珠：PPI新研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在生物系统中扮演着至关重要的角色。然而，鉴定这些相互作用一直是一个挑战，尤其是对于那些由翻译后修饰（PTMs）介导的低亲和力相互作用。传统的方法，如下拉法、免疫共沉淀法（Co-IP）和串联亲和纯化质谱法（TAP-MS），虽然有效，但往往受到非特异性相互作用的干扰。近年来，光亲和连接技术被认为是一种理想的工具，能够通过光激活将亲和相互作用转化为共价连接，从而冻结低亲和结合相互作用。这项技术的一个关键优势是，它能够显著减少非特异性相互作用，从而提高检测的特异性和分辨率。在这项研究中，研究者开发了一种新型的光亲和磁珠（PAMBs），通过引入PEG钝化层来减少非特异性相互作用。这种光亲和磁珠能够捕获与特定甲基化位点相互作用的蛋白质，从而鉴定出与Flap内切酶1（FEN1）蛋白上特定甲基化位点相互作用的蛋白质。与传统的生物亲和素下拉系统相比，这种方法显著减少了干扰蛋白的数量（减少80%以上），同时增加了蛋白质亚类的数量。光亲和连接技术的另一个优势是，它能够识别那些动态地介导低亲和力相互作用的蛋白质。这使得这种方法成为研究低亲和力PPIs的有力工具，有助于发现新的PTM介导的相互作用靶点。总的来说，光亲和磁珠技术为研究蛋白质相互作用提供了一种新的、有效的手段。通过将这种技术整合到下拉系统中，研究者能够更深入地探索细胞过程的分子机制，从而为生物学研究带来新的见解。

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IP、CO-IP和Pull-down实验有啥区别？原创玉珠隆生物 Uselong Biotech 2024年10月02日 07:25 北京 10人听过免疫沉淀技术是一种基于抗体和抗原特异性相互作用的经典方法，广泛应用于蛋白质相互作用、蛋白质与遗传物质相互作用的研究。它能有效确定细胞内两种蛋白质的生理性相互作用，并用于抗原检测和蛋白质纯化。衍生技术包括CO-IP（共沉淀法）、ChIP（染色质免疫沉淀技术）、RIP（RNA免疫沉淀技术）。免疫沉淀（Immunoprecipitation，简称IP）利用特定抗体与目标蛋白结合，从混合物中沉淀出目标蛋白，实现蛋白的纯化与鉴定。其作用为富集和检测特定蛋白，提供高纯度样本以供后续分析。免疫沉淀技术不仅可以用于研究蛋白质的存在、表达量、稳定性和翻译后修饰，还可以用于研究蛋白质-蛋白质相互作用，揭示蛋白质复合物的组成，是蛋白质组学研究中的重要工具。 IP技术的基本流程包括以下几个步骤：①细胞裂解：首先需要收集细胞并裂解，以便释放细胞内的蛋白质。②抗体结合：将偶联特定的抗体填料或磁珠加入到裂解物中，抗体会与其目标蛋白特异性结合。③沉淀：将抗体-蛋白复合物通过离心或使用磁吸方式沉淀下来。④洗涤：去除未结合的蛋白质和其他杂质。⑤洗脱：使用适当的缓冲液将沉淀的抗体-蛋白复合物洗脱，以便进行后续分析，如Western blot或质谱分析。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，简称Co-IP）技术是一种研究蛋白质相互作用的有效方法。它通过使用针对特定蛋白质的抗体来沉淀该蛋白质及其相互作用的复合物，进而研究与已知蛋白质相互作用的其他蛋白质。Co-IP技术原理是基于抗体与抗原的特异性结合，利用特定抗体沉淀目标蛋白，同时将与目标蛋白相互作用的其他蛋白质一同沉淀下来。Co-IP的主要作用是检测两种蛋白质在体内是否相互作用，以及揭示它们之间的相互关系。通过Co-IP技术，可以识别和鉴定与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而构建蛋白质相互作用网络。鉴定蛋白质复合物：Co-IP技术有助于发现目标蛋白的结合伙伴，对于了解蛋白质的功能、调控机制以及信号传导途径至关重要。 Co-IP技术的基本流程包括以下几个步骤：①样品准备：收集细胞或组织样本，用适当的缓冲液洗涤样本以去除杂质。②细胞裂解：使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液在冰上裂解细胞，裂解应在低温条件下进行以防止蛋白质降解。③裂解液澄清：将裂解液进行离心（通常为4Ⰳ，高速离心），以去除不溶性颗粒和细胞碎片，取上清液进行后续实验。④抗体预结合：将特异性抗体与蛋白A/G磁性珠或其他固相支持物预结合，预结合通常在旋转条件下4Ⰳ孵育30分钟到1小时。⑤免疫沉淀：将预结合的抗体-磁性珠复合物加入到裂解液中，在4Ⰳ下旋转孵育1-2小时或过夜，以允许抗体与目标蛋白充分结合。⑥捕获复合物：使用磁力架收集磁性珠或通过离心收集非磁性珠，去除未结合的蛋白质的上清液。⑦洗涤：用裂解缓冲液重复洗涤磁性珠几次，以去除非特异性结合的蛋白质，每次洗涤后，再次使用磁力架或离心收集珠子。⑧洗脱：使用洗脱缓冲液（如SDS样本缓冲液）洗脱目标蛋白和相互作用的蛋白质，洗脱通常在室温下进行，并可能需要加热。洗脱完成后使用WB或质谱等其它方法对洗脱的蛋白进行检测即可。 Co-IP的优点：①体内天然构象：CO-IP分析中，诱饵蛋白和猎物蛋白保持它们在体内的天然状态，有助于更真实地模拟它们之间的相互作用。②体内相互作用：诱饵蛋白与猎物蛋白的相互作用在体内发生，受外界条件影响较小，有利于减少实验中的干扰因素。③快速高效：如果已有特异性抗体，CO-IP实验过程可以快速进行，无需进行目标蛋白的克隆和异源表达。Co-IP的缺点：①低亲和力互动：对于亲和力较低或短暂性的蛋白质相互作用，CO-IP可能无法有效检测。②直接或间接互动：CO-IP结果可能无法明确区分蛋白质间的相互作用是直接的还是通过其他蛋白质间接发生的。③抗体依赖性：CO-IP方法需要特定的抗体支持，这限制了其在没有合适抗体的情况下的应用。融合蛋白沉降试验(Pull-down)是一种用于检测蛋白质相互作用的体外实验技术，它不仅可以验证已知蛋白质之间的相互作用，还可以用来筛选可能与已知蛋白质相互作用的新蛋白质。 Pull-down技术利用带有特定标签（例如GST标签、His标签或生物素标签）的融合蛋白作为“诱饵”，将这些融合蛋白固定在亲和树脂上。当目标蛋白或细胞裂解液通过这个系统时，任何能与诱饵蛋白结合的“猎物”蛋白将被吸附和沉淀；通过洗脱步骤，可以将捕获的蛋白质复合物从树脂上洗脱下来；最后，使用蛋白印迹（Western blot）或质谱等技术分析洗脱的蛋白质，以验证预测的蛋白质相互作用或发现新的相互作用。Pull-down实验用于检测两种蛋白质在体外条件下是否能够直接结合。其主要应用包括：①验证已知蛋白质相互作用：通过使用一个已知蛋白质作为诱饵，可以验证它与另一个蛋白质的潜在相互作用。筛选新的蛋白质相互作用：当与细胞裂解液或蛋白质混合物孵育时，Pull-down可以用来发现与诱饵蛋白相互作用的未知蛋白质。 Pull-down技术的基本流程包括以下几个步骤：①准备诱饵蛋白：通过重组DNA技术将目标蛋白与亲和标签（如GST、His等）融合表达，诱导表达并收集含有融合蛋白的细胞，裂解细胞并纯化融合蛋白。②固定诱饵蛋白：将纯化的融合蛋白与亲和树脂（如谷胱甘肽珠子对于GST标签，或金属离子珠子对于His标签）孵育，使融合蛋白固定在树脂上。③准备细胞裂解液：收集将要用于筛选的细胞或组织，裂解细胞或组织，制备细胞裂解液，并离心以清除不溶性颗粒。④孵育裂解液：将固定有诱饵蛋白的树脂与细胞裂解液混合孵育，允许足够的时间让任何可能的相互作用发生。⑤洗涤：孵育后，通过离心收集树脂，并用适当的缓冲液洗涤几次，以去除未结合的蛋白质和杂质。⑥洗脱：使用特定的洗脱缓冲液或条件（如改变pH或添加竞争性配体）从树脂上洗脱结合的蛋白质复合物。⑦分析：将洗脱的蛋白质复合物进行Western blot分析或质谱分析以鉴定相互作用的蛋白质。 Pull-down优点：①低丰度蛋白复合物纯化：Pull-down技术能有效纯化低丰度蛋白质复合物，这对于分析和研究特定蛋白质相互作用至关重要。②体外研究应用广泛：该技术被广泛用于体外转录或翻译系统的研究，为研究者提供了一个有效的研究工具。 Pull-down缺点：①标签影响：引入的蛋白质标签可能会影响与内源性复合物的竞争，可能导致对实验结果的误解。②生理相关性：Pull-down技术虽然能检测蛋白质间的相互作用，但这些相互作用可能并不代表它们在生理条件下真的会在体内相遇和结合。蛋白纯化技术交流，请添加我们的微信：抗体63 蛋白质33 磁珠96 蛋白纯化167 抗体 ⷠ目录上一篇抗体偶联药物(ADC)简介及开发关键点下一篇抗体药物开发全流程梳理-简单易懂个人观点，仅供参考阅读 9603

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