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质粒提取试剂盒在线播放_质粒提取试剂盒天根(2024年12月免费观看)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：导读更新日期：2024-12-02

质粒提取试剂盒

质粒转化实验全攻略：从准备到提取质粒的转化实验主要包括三个部分：感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和质粒DNA的提取。以下是详细的步骤：（Ⅰ）感受态细胞的制备从活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。将菌悬液按照1:100的比例转接到100ml液体培养基中，37℃振荡扩大培养，2~3小时。当培养液开始浑浊时，间断性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。将培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20分钟，0℃-4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30分钟。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率） 4℃离心10分钟（4000r/min）。弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。（Ⅱ）质粒DNA的转化取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入1ul质粒DNA混匀，同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA。若解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。冰浴30分钟，离心管放到42℃保温90秒（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30分钟，可能影响转化率。然后迅速冰浴2分钟。向离心管加800ul LB液体培养基，37℃振荡培养1小时（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30分钟。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16小时，出现菌落。菌落结果：无菌落：失败或者培养条件不充分。布满菌落：呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。布满菌落：浓度太高，失败。出现菌落：符合要求。（Ⅲ）质粒DNA的提取质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。

分子生物学小技巧：质粒提取全解析 𐟧슨𔨧𒒦取是分子生物学实验中的基本操作，但你真的了解其中的原理吗？很多人只知道使用试剂盒中的P1、P2、P3溶液，却对具体成分和作用一知半解。今天，我们就来深入探讨质粒提取的背后原理，让你真正掌握这项技术！质粒提取的基本原理 𐟌 质粒是独立于染色体外能够自我复制的环状DNA分子。质粒提取采用的是强碱裂解法。基本原理是：细菌悬浮液暴露于高PH的强阴离子洗涤剂中，细胞壁被裂解，染色体DNA和蛋白质发生变性，相互缠绕形成大型复合物。然后被十二烷基硫酸盐包裹，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中沉淀下来，离心去除后，质粒DNA就存在于上清液中。由于DNA带负电，而质粒提取柱相当于一个阴离子柱，能够在高盐的条件下吸附DNA，然后通过去离子水洗脱，就得到纯化的质粒DNA了。 P1、P2、P3到底是什么？ 𐟧ꊐ1: 1M Tris-Hcl(PH8.0)25 mL + 0.5 MEDTA(PH8.0) 10mL 加超纯水定容至500mL，温热灭菌，常温保存。用时现加RNase。 P2: NaOH 4g + SDS 5g。加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。 P3: 乙酸钾147.21g + 冰醋酸57.5mL，加超纯水定容至500mL, 湿热灭菌, 常温保存。实验步骤详解 𐟏튥ꌥ‰试剂准备：从培养箱中取出前一天摇的菌液，从中取2mL离心，去上清，备用。P1在使用前加入RNA酶。菌体裂解：根据试剂说明，向含有菌体沉淀的EP管中加150 P1，震荡管底，使菌体全部溶解于溶液1中。然后加入150 P2，温和地上下翻转EP管8-10次。加入500 P3，立即剧烈翻转EP管8-10次，此时EP管中出现白色絮状沉淀。过柱纯化：将EP管12000转离心1分钟，用枪头小心地吸出上清液至收集柱中。12000转离心1分钟，弃去滤液，向收集管中加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液，重复加入500 PW漂洗液，12000转离心1分钟，弃去滤液,12000转离心2分钟。把收集柱装入新的EP管中，室温晾干5分钟。在收集柱的膜中加入50提前预热的EB buffer或去离子水。室温静置1分钟。12000转离心2分钟。得到质粒DNA溶液。常见问题解答 𐟛 ️ 质粒提取的得率低或无质粒：可能是菌体老化或质粒拷贝数低。可以重新涂布筛选，挑选新的菌落进行液体培养。碱裂解不充分：收集的菌体含量较高时，可以酌情提高溶液P1、P2、P3的含量。乙醇残留：漂洗液没有去除干净。可以两遍醇洗以保证盐离子完全清除。洗脱处理不当：洗脱液加入较多或者洗脱时间过短。可以提前将洗脱液加热，从而加速DNA从柱体的脱离。质粒的纯化不足：可能混有RNA或基因组DNA。可以避免加入溶液P2、P3时剧烈震荡，减少菌体用量。总结 𐟓 看完这篇，你是不是对质粒提取的原理有了更深入的了解？下一期，我们将继续探讨大提质粒的技术。记得关注哦！

中量质粒提取，关键步骤！在分子克隆实验中，质粒的质量至关重要，它直接影响后续实验的效果。今天，我们来探讨如何使用EndoFree Plasmid Midi Kit进行中量提取/制备质粒，并分享一些关键步骤和注意事项。 𐟔 Part I: 准备工作确认P1溶液中已加入RNase，并记得及时放回4度保存。加入buffer P1后，用vortex充分混匀，确保菌块完全裂解。加入buffer P2后，温和混匀，避免打断基因组DNA。加入buffer E3后，立即混匀，防止局部沉淀。 𐟔 Part II: 激活与洗涤使用去内毒素的试剂盒，避免内毒素影响细胞实验。激活柱子，确保Buffer PW中已加入指定体积的100%乙醇。建议用Buffer PW再多洗涤一次，确保质粒纯净。 𐟔 Part III: 洗脱与预热将灭菌蒸馏水提前预热至60度，提高洗脱效率。去除吸附柱中残留的乙醇，以免影响后续酶促反应。建议分两次洗脱，以提高洗脱效率。 𐟑‰ 此外，建议在每一步的间隙为下一步做准备，比如捏管子做标记等，尤其是一天要提几百个质粒的情况。

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

𐟔젨獵𛆦�꤯𜁥悤𝕦取质粒DNA 𐟓– 一、操作步骤：准备20ml灭菌过的培养管，编号，分别加入8ml LB培养基，再加入8⵬ 相应抗生素，可适量多加；用枪头挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜；取2ml过夜培养的菌液加入离心管中，室温10000rpm离心2min，去上清；（可重复步骤2，直至菌液离心完) 向留有菌体沉淀的离心管中加入250⵬ Buffer P1（含RNase A），使用移液枪充分混匀，悬浮菌体；向离心管中加入250⵬ Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4~6次，获得澄清的裂解液；（剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度）向离心管中加入350⵬ Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4~6次，此时出现白色絮状沉淀。室温10000rpm离心15min；将步骤6中所得的上清液转移至洁净的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000rpm离心1min，至裂解物完全通过吸收柱,倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加150⵬ Buffer PB，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；向吸附柱中加400⵬ Buffer PW（检查是否加入无水乙醇），10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。再空离一次，2min（此时可以加热 Buffer EB，65~70℃）；将吸附柱置于一个新的离心管中，打开盖子，吹风4min左右（确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤）；向吸附柱的吸附膜中间部位加90⵬ Buffer EB（pET系列拷贝数低，加EB 70即可），室温静置2min。10000rpm离心1min；把液体倒回吸附柱，在10000rpm离心1min；混合质粒至一个离心管中，做好标记，开盖室温放置两小时左右。-40℃保存质粒。二、注意事项：使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。 Buffer EB在65~70℃水浴预热，可以增加提取效率。

质粒提取的四种方法及其适用范围质粒提取是一种常见的实验技术，用于从细菌或其他生物体中获取纯净的质粒DNA。质粒提取的目的是为了进行后续的分子生物学实验，如基因克隆、基因表达和转基因等。我们通常使用商业化试剂盒来进行质粒提取，这些试剂盒可以根据实验目的和样品来源进行分类。碱裂解法 𐟌꯸ 原理：碱裂解法利用碱性溶液破坏细菌细胞壁和细胞膜，从而使质粒DNA从细胞中释放出来。碱性条件会导致细胞膜和细胞壁的破裂，释放出质粒DNA。随后通过中和和沉淀步骤进行纯化，去除蛋白质和其他杂质。适用范围：碱裂解法适用于从大多数常见细菌中提取质粒DNA，特别适合小规模提取和常规实验。高盐法 𐟧‚ 原理：高盐法利用高盐浓度破坏细菌细胞膜和蛋白质，从而使质粒DNA从细胞中释放出来。高盐浓度会导致细胞膜的破裂和蛋白质沉淀，从而实现质粒DNA的纯化。适用范围：高盐法适用于从各种细菌中提取质粒DNA，包括一些难以处理的细菌株。这种方法对于大规模提取和高纯度要求的实验较为适用。硅胶柱层析法 𐟏튥ŽŸ理：硅胶柱层析法使用硅胶柱作为质粒DNA的吸附材料。样品中的质粒DNA在硅胶柱上结合，而杂质则被洗脱。然后通过洗涤和洗脱步骤，纯化质粒DNA。适用范围：硅胶柱层析法适用于从各种来源的细菌中提取质粒DNA，包括高GC含量的细菌。这种方法通常能提供较高的纯度和较好的质粒DNA回收率。磁珠法 𐟧ꊥŽŸ理：磁珠法利用磁性珠子表面的特定配体与质粒DNA结合，然后通过磁场将质粒DNA与磁珠分离。杂质则被去除，最后通过洗涤和洗脱步骤纯化质粒DNA。适用范围：磁珠法适用于从各种来源的细菌中提取质粒DNA。这种方法具有快速、高效、自动化的特点，适用于高通量实验和高纯度要求的实验。实验常见问题和措施 𐟚芦𑡦Ÿ“：在质粒提取过程中，可能会发生DNA污染，导致提取的质粒DNA样品的纯度下降。为了避免污染，需要注意使用无菌操作和洁净的实验环境。 DNA降解：DNA在提取过程中容易受到核酸酶的降解。为了保护DNA的完整性，可以在提取过程中添加核酸酶抑制剂，避免长时间曝光在室温下，以及避免多次冻融循环。低得率：有时候质粒提取的得率较低，可能由于菌落密度不足、提取方法不当等原因。为了提高得率，可以增加菌落培养的时间和密度，使用适当的提取方法，并根据实验需要优化提取步骤。在进行质粒提取实验时，需要注意操作规范和控制实验条件，以确保提取的质粒DNA质量和纯度的准确性和可靠性。

重组质粒构建全流程，小白必看❗️ 最近有不少实验小白在质粒构建上遇到困难，真是让人心疼啊！𐟘⠤𘺤𚆥𘮥Š饤祮𖩡𚥈饺樿‡这个阶段，我特意整理了重组质粒构建的详细流程，赶紧收藏吧！𐟓– 第一步：获取目的基因片段首先，你需要通过PCR扩增出带有酶切位点的目的基因片段。引物设计时要带上酶切位点，这样后续才能顺利连接。PCR完成后，跑胶鉴定一下片段长度，确保无误。𐟔슧쬤𚌦�𜚨ƒ𖥛ž收接下来是胶回收步骤。切胶前记得打开水浴锅，75℃，这样可以节省时间。按照试剂盒的protocol操作，测定浓度。新手一定要注意用完水浴锅后关掉或者调低温度，不然很容易烧干，很危险哦！𐟔劧쬤𘉦�𜚨🞦Ž奏应将回收的目的基因片段与载体进行连接。10ul体系，16℃过夜。连接酶用Solution I，片段和载体的量根据浓度调整。𐟔— 第四步：转化第二天早上进行转化。取菌和质粒（或连接产物），冰上融化。将质粒或连接产物转移到菌中，质粒一般5-10ng，混匀后放冰上30min（时间可以适当减少到10-15min）。然后热击42℃，90s，放冰上2min。加入800ul LB培养液，37℃半小时（水浴或者摇床）。此时把培养平板拿出放入培养箱预热。𐟧Š 第五步：涂板 30min孵育结束后，取出培养液，离心：5000g，3-5min。吸去上清，留约50-60ul培养液，涂板。放到37℃培养箱中培养。一般我是下午五六点放进去，差不多隔天早上八点多菌落长到合适大小。𐟏𚊧쬥…�导š挑取单克隆第三天早上挑取单克隆，摇菌。我一般挑20个，EP管里放1ml LB培养液，挑菌放进去就可以了。摇2-3h即可。𐟚늧쬤𘃦�𜚨Œ液PCR 做菌液PCR，模板用2ul菌液即可。引物用目的基因片段的引物，目的是初步鉴定是否构建成功。𐟧슧쬥…릭导š送测序挑取跑胶阳性的菌液，送测序。这样就能知道你的质粒是否构建成功啦！𐟔 第九步：毕业+1 最后，祝大家都能顺利毕业！𐟎“ 希望这个流程能帮到你们，祝实验顺利！𐟒ꀀ

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

萤火素酶互补实验技术全攻略 𐟔 实验细节解析 𐟓– 表达载体的选择构建成功的重组质粒是实验成功的关键。目标基因与报告基因必须在同一个阅读框，这是首要条件。其次，选择正确的融合位置也很重要。例如，NLuc通常位于目标蛋白的C末端，而CLuc可以位于N末端或C末端。为了更精确地检测NLuc和CLuc，表达载体中加入了3XHA标签，方便用HA抗体检测。 𐟔砨ᨨ𞾨𝽤𝓧š„构建随着克隆技术的进步，推荐使用In-Fusion反应进行载体构建，具体方法可参考试剂盒说明书。 𐟓Š 正负对照的设置每次实验都应设置正负对照以确保实验体系的可靠性。正对照可以选择已经发表的互作蛋白质对。负对照则应选用与待检测蛋白具有相似亚细胞定位但不互作的蛋白质，或者选择没有活性的突变蛋白。 𐟔 蛋白检测的重要性只有当融合蛋白正确表达时，才能判断目标蛋白之间是否存在相互作用。如果待测蛋白没有互作，即使正负对照都正常表达，也需要用WB检测待测目标蛋白质对在瞬时表达体系中的表达及表达丰度。 𐟔젥䧨焦表›‹白质互作的筛选和验证 LCA技术可以定性检测和定量检测蛋白质的互作，为大规模筛选和验证提供有力工具。

定点突变：科研中的小技巧与心得 𐟔在科研中，探究蛋白质功能的一个关键方法是定点突变。通过改变蛋白质中的一两个氨基酸残基，可以研究这种变化对蛋白质结构和功能的影响。 𐟔基因定点突变（site-directed mutagenesis）是一种定向改变蛋白质序列的方法。首先确定要改变的氨基酸残基位置，然后通过PCR技术定向修改基因序列，从而探讨蛋白质功能的变化。 ✍️以下是一些在进行定点突变时发现的问题和心得体会： 1️⃣ 试剂选择：很多研究者为了方便直接购买昂贵的试剂盒，其实可以选择同一品牌的散装试剂，如高保DNA聚合酶和游离碱基等。参考试剂盒的说明书，可以自行配制类似效果的体系。 2️⃣ 引物设计：设计引物时，尽量保持GC含量较低，但退火温度要适当高一些，建议在65℃左右。如果突变位点附近GC含量高，可以考虑使用GC rich buffer，可以有效提高突变成功率。 3️⃣ PCR体系优化：定点突变的关键在于引物设计和PCR体系的设置。延伸和后延伸的温度和时间非常重要。延伸时间根据使用的聚合酶质量来定，后延伸一般设置为10-15分钟。延伸温度选择68℃或72℃，退火温度尽量低于延伸温度1-2℃。 4️⃣ 琼脂糖电泳回收：是否需要将突变质粒进行琼脂糖电泳回收去杂，这并不是必要的步骤。残留的聚合酶和游离碱基等对转化BL21受体菌的影响不大，反而可能降低转化率。 5️⃣ DpnI酶消化：如果条件允许，可以使用DpnI酶消化模板质粒。经过多轮PCR反应后，模板质粒已经很少了，因此带来的假阳性可以忽略不计。后续可以通过双酶切和测序验证是否为阳性突变子。通过这些小技巧和心得体会，可以有效提高定点突变的成功率，为科研工作提供有力支持。

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