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质粒最新娱乐体验_关于质粒正确的是(2024年12月深度解析)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：话题更新日期：2024-12-02

质粒构建全攻略：从零开始到成功转化 𐟎‰ 看着那些又大又圆的转化子，心情是不是特别美妙？质粒构建其实并不难，只要掌握了基本流程和技巧，你也能轻松搞定！下面我就来详细讲解一下质粒构建的整个过程。质粒构建的基本流程 𐟓œ 首先，我们需要准备好插入片段和载体。插入片段可以是gDNA、cDNA或者已有的质粒，只要上面有你需要的片段就行。然后，用PCR扩增出目标片段，回收这个片段。注意，PCR一般用pfu酶，如果扩增不好可以试试g或者保真较好的Taq。设计引物 𐟔犊设计引物时，需要在引物末端加入合适的酶切位点，这样可以让插入片段和载体进行连接。常见的酶切位点有Sacl、HindIII、EcoRI和KpnI等。你也可以采用同源臂的设计，让载体和插入片段通过同源重组进行连接。去磷酸化处理 𐟌Š 在利用单酶切位点或者同尾酶进行克隆连接时，为了防止载体自身环化，需要对载体进行去磷酸化处理。常用的碱性磷酸酶有Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)或者Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)。去磷酸化反应体系一般包括酶切胶回收后的载体DNA、10xSAP buffer、SAP酶和H2O，总体积20ul。大肠杆菌的转化 𐟦 在实验前，将金属浴或者恒温水箱调至42℃。然后从-80℃冰箱取出感受态细胞，于冰上化冻。接着将连接或者无缝克隆产物全部加入100ul感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰上静置15~20分钟。然后42℃热激90秒，迅速置于冰上2分钟。接着在超净台内向热激后的细菌中加入400-800ul不含抗性的LB培养液，置于恒温摇床内37℃200rpm恢复30~45分钟。离心后倒出大部分LB，留少许约100-150ulLB，在超净台吹匀沉淀菌体，将菌体悬液均匀涂布在含有对应抗性的LB平板上（取决于转化的质粒载体抗性，如Amp*或者Kan*）。将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱内培养12-16小时。最后挑取6~10个菌落进行菌落PCR鉴定，或者直接进行液体培养，提取质粒后用酶切的方法鉴定阳性克隆。保存阳性菌 𐟧Š 将鉴定出来的阳性菌进行保存，于标记好的冻存管中，每管中加入30%甘油和300新鲜细菌培养液，充分混匀后置于-80℃保存。注意事项：①如果转化的是纯质粒（非连接或者重组产物），一定要降低使用量和感受态细胞使用量、及涂布细菌量。②-80℃保存菌液时，可以在提质粒时留一点备用。希望这篇攻略能帮到你，祝你早日构建出成功的质粒！𐟚€

质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳实验全攻略 𐟓… 实验日期：2024年9月2日 𐟑堥ꌥ𐏧𛄯𜚥Œ组人 𐟓 实验目的：掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法和原理掌握质粒DNA琼脂糖凝胶电泳及结果分析 𐟔젥ꌥŽŸ理：质粒是一种环状双链DNA，大小从1kb至200kb不等，存在于细胞质中，独立于细胞染色体之外，自主复制的遗传成分。碱裂解法提取质粒DNA：菌体在pH12.0-12.5的范围内，DNA双螺旋结构解开变性，但环状质粒DNA的氢键虽断裂但两条互补链彼此依然相立盘绕紧密结在一起。当加入中和液后，质粒DNA分子迅速复性，呈解状态，通过高速离心，质粒DNA与细胞碎片等杂质分离。 𐟧ꠥꌦ�꤯𜚊1️⃣ 过夜培养的菌液于离心管内，10000rpm离心尽量弃上清。 2️⃣ 将细菌重悬于2ml Buffer I中（已加入RNase A），用移液器反复吸打彻底悬浮细菌沉淀。 3️⃣ 加入210 Buffer II，温和的上下颠倒4-6次使菌体充分裂解，直到菌液变得粘稠，用移液器不应起过剧搅拌以免质粒受到破坏。 4️⃣ 加入LB，立即上下颠倒4-6次，此时出现白色絮状沉淀，离心形成沉淀。 5️⃣ 将步骤4中的上清加入到已装入收集管的吸附柱中，注意不吸出沉淀，离心1分钟，倒掉收集管中间废液，将吸附柱放回收集管中。 6️⃣ 加入500 Buffer W2，离心1分钟，倒掉收集管中的废液。 7️⃣ 向吸附柱中加入500 Buffer W2，再次离心1分钟，倒掉收集管中的废液。 8️⃣ 将吸附柱重新放回收集管中，离心2分钟，倒掉收集管中的废液。 9️⃣ 将吸附柱置于室温数分钟以彻底干燥。 𐟔Ÿ 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜中滴加50 Buffer EB，室温放置2分钟，离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。 1️⃣1️⃣ 制备琼脂糖凝胶，加样后电泳分析观察结果。 ⚠️ 注意事项：器具清洗干净，防止外源性核酸酶对DNA的降解。每次起跑菌液量应控制在4ml，菌量大小影响溶菌酶对质粒DNA的释放和纯化时的纯度。培养时间不要超过6小时，细菌会崩解引起大量死亡导致质粒丢失。 Buffer W2使用前置于4℃保存。加入Buffer W2后不要剧烈搅拌4-6次即可。剧烈搅拌会导致基因组DNA污染。加入Buffer W2的时机要适中，既要保证质粒DNA不因作用时间过长发生不可逆变性。 𐟓Š 实验结果：提取的质粒DNA可能拥有不同构象，因此呈现非单带可能螺旋状。不同泳道的亲亮度不同，提示质粒含量不同，亲带成亮说明DNA含量越高（结后的核酸材料越多），也该明那一组提取的质粒度越纯。可能出现电泳条带不切一的情况，可能是由于加样时从组成孔内样分不均影结果。也可能是由于样品浓度太高，凝胶制不花，导致拖带。加样时手抖可用另一手按住胶板边缘，加样之对准孔底，以免加到孔壁上而影响实验结果。 𐟔젥ꌥˆ†析：在本次实验中，我们掌握了碱裂解法提取质粒DNA的方法和原理，并成功进行了琼脂糖凝胶电泳分析。通过实验结果可以看出，提取的质粒DNA可能拥有不同构象，不同泳道的亲亮度不同提示质粒含量不同。实验过程中需要注意器具清洗干净、控制菌液量、培养时间以及Buffer W2的使用方法等细节。希望本次实验能为其他同学提供一些参考和帮助。

质粒电泳出现多条带？原因及解决方法详解 𐟘𑥜訿›行琼脂糖凝胶电泳时，发现胶上出现的不是单一条带，这可能是由什么原因引起的呢？让我们一起来探讨一下吧！ 𐟔正常情况下，质粒是双链闭合的DNA。但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度或试剂等因素，质粒DNA链可能会发生断裂。在电泳过程中，这些断裂的质粒DNA可能会形成开环结构，甚至解开螺旋变成线形。因此，大多数质粒提取物中会含有三种构型的质粒。 𐟌€质粒的三种形态： 1️⃣ 线形DNA：两条链都断裂，呈线性分子； 2️⃣ 开环DNA：一条链断裂，呈松弛的环状分子； 3️⃣ 共价闭合环状DNA：两条链没有断裂，呈超螺旋结构。 𐟏Ž️这三种形态在电泳时的分离速度不同，分离率顺序为：超螺旋DNA > 线性DNA > 开环DNA。 𐟒᤺†解这些信息后，如果你在实验中遇到类似问题，就可以更好地理解和解决问题所在啦！

重组质粒构建全流程，小白必看❗️ 最近有不少实验小白在质粒构建上遇到困难，真是让人心疼啊！𐟘⠤𘺤𚆥𘮥Š饤祮𖩡𚥈饺樿‡这个阶段，我特意整理了重组质粒构建的详细流程，赶紧收藏吧！𐟓– 第一步：获取目的基因片段首先，你需要通过PCR扩增出带有酶切位点的目的基因片段。引物设计时要带上酶切位点，这样后续才能顺利连接。PCR完成后，跑胶鉴定一下片段长度，确保无误。𐟔슧쬤𚌦�𜚨ƒ𖥛ž收接下来是胶回收步骤。切胶前记得打开水浴锅，75℃，这样可以节省时间。按照试剂盒的protocol操作，测定浓度。新手一定要注意用完水浴锅后关掉或者调低温度，不然很容易烧干，很危险哦！𐟔劧쬤𘉦�𜚨🞦Ž奏应将回收的目的基因片段与载体进行连接。10ul体系，16℃过夜。连接酶用Solution I，片段和载体的量根据浓度调整。𐟔— 第四步：转化第二天早上进行转化。取菌和质粒（或连接产物），冰上融化。将质粒或连接产物转移到菌中，质粒一般5-10ng，混匀后放冰上30min（时间可以适当减少到10-15min）。然后热击42℃，90s，放冰上2min。加入800ul LB培养液，37℃半小时（水浴或者摇床）。此时把培养平板拿出放入培养箱预热。𐟧Š 第五步：涂板 30min孵育结束后，取出培养液，离心：5000g，3-5min。吸去上清，留约50-60ul培养液，涂板。放到37℃培养箱中培养。一般我是下午五六点放进去，差不多隔天早上八点多菌落长到合适大小。𐟏𚊧쬥…�导š挑取单克隆第三天早上挑取单克隆，摇菌。我一般挑20个，EP管里放1ml LB培养液，挑菌放进去就可以了。摇2-3h即可。𐟚늧쬤𘃦�𜚨Œ液PCR 做菌液PCR，模板用2ul菌液即可。引物用目的基因片段的引物，目的是初步鉴定是否构建成功。𐟧슧쬥…릭导š送测序挑取跑胶阳性的菌液，送测序。这样就能知道你的质粒是否构建成功啦！𐟔 第九步：毕业+1 最后，祝大家都能顺利毕业！𐟎“ 希望这个流程能帮到你们，祝实验顺利！𐟒ꀀ

质粒那些事儿，必看小技巧！拿到质粒后，首先要确保你拿到的是全序列。最保险的做法是自己测序，至少要把核心区域测了。比如说，一个一万五六千bp的质粒，测个七八千bp的核心区域，也就几百块钱。这样能确保质粒没问题，后面再用也不怕浪费时间和推倒重来。有个网友做木本植物的基因编辑，稳定转化后拿到了100多个抗性芽，但检测不到靶基因编辑。我第一反应就是质粒有问题。建议他去测个序，结果发现cas9上有单核苷酸突变，很可能导致cas9功能丧失，核酸切割能力下降，最后检测不到基因编辑事件。还有一个例子是，有个年轻老师在国外做博士后时，实验室集中力量给一个中国博士做课题，想堆大文章。做到后期发现实验结果和假说反着来，总有些地方说不通。最后确定是质粒出了问题，测序发现质粒有突变。结果前面所有跟质粒相关的实验都得推倒重来，项目进度被大大拖延。那个老师当时又要回国，签证都快到期了，真是惨不忍睹。有些质粒的部分区域没有标出来，可以去NCBI上Blast，总会找到蛛丝马迹，甚至有的会很明确地标出来具体是什么东西。我最喜欢的画质粒图谱的软件是SnapGene，这个软件的厉害之处用过的人都知道，真的非常方便。在动手做质粒相关的实验前，一定要学会如何阅读图谱。看关键区域，每一个元件的作用都要轻车熟路才能去做下一步实验。质粒上的酶切位点，尤其是常用的，都要标出来。有的酶切位点是单个切点，有的有两个甚至多个。哪怕是构建载体这种小实验，也要事先把每一步在理论上都演练一遍，弄得清清楚楚，这样成功的概率才会高，才会真的节省时间。构建载体时建议把方案给有经验的人看看，有时候人是当局者迷，旁观者清。没发现问题最好，发现了问题也可以庆幸自己多留了个心眼。

上海名校寒假探究报告指南𐟓š 𐟔夸𛩢˜：大肠杆菌质粒DNA抽提 𐟌 对象：5-9年级学生 ⏰时间：寒假 𐟓地点：上海草心科创教育基地 --- 探究报告撰写指南𐟓 研究背景(100字) 简要介绍研究的目的和重要性，说明为什么选择这个课题。研究方法(50字) 描述研究过程中使用的具体方法，如文献法、问卷法、访谈法等。实践方法和过程(300字) 详细描述实验的具体步骤和方法，建议使用小标题，使流程更加清晰。研究结果(50字) 总结实验的主要发现和结论。探究体会与思考(200字) 撰写个人对研究的体会和思考，包括对实验结果的理解和对未来研究的展望。 --- 展望与思考(50-100字) 对研究结果的进一步思考，以及如何将研究结果应用于实际问题。对研究的总结(100-150字) 总结研究的主要发现，并与研究背景相呼应。

𐟔쩇组质粒构建全流程大揭秘𐟔 𐟌𑦜즜Ÿ，我们为大家带来重组质粒构建的详细流程，适合新手小白，建议收藏哦！ 𐟔„一、重组反应：片段与载体连接以2片段重组为例，重组体系如下： 2x重组酶：5ul 酶切后载体：1ul PCR产物1：2ul PCR产物2：2ul 总体积：10ul 反应条件：50度连接30分钟，按照重组酶说明书进行。 𐟓‹二、重组产物的转化全量10ul加入至感受态细胞中，冰上放置40分钟。 42℃水浴锅内热激90秒，让质粒进入感受态细胞。取出冰上放置5分钟，关闭感受态细胞。加入200ulLB无抗液体培养基，37℃摇床培养1小时。将培养液涂布在含AMP的LB固体培养基上，过夜培养。第二天晚上五点左右挑菌，在5mlLB液体培养基（加5ulAMP）中摇床培养，38℃过夜。 𐟒ᥰ贴士：建议挑菌后，将培养的质粒用于第二天提取，确保质粒构建成功。 𐟔쩀š过以上步骤，你就能成功构建重组质粒啦！记得做好记录和标记哦~

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这周，我替师弟构建了近50个质粒 𐟤🙥‘诼Œ我替师弟构建了近50个质粒，真是让人心累。说出来你可能不信，整整五年，从博士后到新来的博士，我们课题组所需的质粒都是我一个人构建的。导师总是理所当然地给我布置任务，理由是全课题组只有我会构建质粒。 𐟘𐠥ˆ멗‘为什么不拒绝，我怕被穿小鞋。导师从来不让一个人单独负责一个课题，而是故意让多人同时负责一个课题，并且所有文章都由他亲自写。你要是让他不爽了，他可以让你连共一都没有。 𐟧ꠥ𓤾🦘樂襍š五延期中，这周我还是被导师要求替希腊师弟构建Dox-inducible shRNA质粒。我花了将近一周的时间才完成这50个质粒的构建，真是心累。 𐟘䠨🙤𘪥凨‘駚„实验室，真是快倒闭吧！

手把手教你构建质粒载体嘿，大家好！今天我们来聊聊如何用质粒构建技术来搞定你的科研项目。作为一个科研小白，这个过程可能会让你有点头大，但别担心，我来帮你理清楚！第一步：双酶切 𐟔ꊩ斥…ˆ，你需要选择合适的酶切位点。这一步是整个过程的起点。常见的酶切体系是这样的：内切酶1：1 内切酶2：1 酶缓冲液：5（根据浓度）载体：2 ddH₂O：补齐到50 37℃酶切1小时。记得在酶切前算好量，先加ddH₂O，最后加内切酶。第二步：切胶回收 𐟧슩…𖥈‡完成后，你需要跑琼脂糖胶来鉴定酶切效果。配胶时注意选择合适的胶浓度，分子量越大，胶浓度越小。跑胶完成后，紫外灯下一般会有两段，分别是载体和切下来的片段。根据结果进行胶回收，注意切下来的片段不回收。胶回收完成后测浓度备用。第三步：连接 𐟔— 插入片段可以根据自己的实验选择，通常可以通过PCR获得，或者是由三方公司合成的序列。在连接开始前，也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下：酶切后的载体：25ng 插入片段：1 T4 ligase buffer：1 T4连接酶：1（根据浓度） ddH₂O：补齐至10 16℃连接4小时以上或过夜。记得加入载体和插入片段的量由说明书得来，加样前计算好量，先加ddH₂O，最后加连接酶。小tips：为确保连接的顺利进行，务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用，不能混用。第四步：转化 𐟦 进行转化时，根据载体说明书选择合适的感受态细胞，常用DH5€‚同时仔细阅读感受态细胞说明书，看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。第五步：挑取单克隆 𐟧𘊦졦—妗餸Š，挑取单克隆，推荐至少选择两个及以上。第六步：摇菌 𐟍𚊦‘‡菌时，注意拧松菌管的盖子或者使用封口膜，倾斜放入恒温（一般为37℃）摇床，摇菌时间8小时为宜。第七步：提质粒送测序 𐟧슦‘‡菌完成后进行质粒提取，测浓度后送测序。注意这里会有部分说明书推荐选择新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定，这也是一种鉴定方式，可以根据酶切片段的大小来判断重组是否正确，但是最终确定还是推荐进行测序。第八步：保菌 𐟧Š 对测序正确的菌株进行保菌，并提质粒进行后续实验。小贴士 𐟒ከ𔨧𒒦ž„建方法多种多样，小伙伴们也可以选择同源重组的方法进行哦！希望这些步骤能帮到你，祝你的科研之路顺利！

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