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pcr体系前沿信息_PCR技术的三个步骤(2024年11月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-11-28

pcr体系

𐟔쒔-qPCR实验室操作全攻略𐟓– 𐟧ꠥ‡†备开始你的RT-qPCR实验了吗？这里有一份超详细的操作指南等你来拿！ 𐟕𐯸 **确定收样时间**：在进行RT-qPCR之前，首先要明确你的干预时间和收样时间。例如，如果你正在研究炎症指标，那么6小时、12小时和24小时的样本可能会有明显的变化。 𐟧꠪*操作步骤**： 1️⃣ 配置你的PCR体系，以20的SYBR Green体系为例。 2️⃣ 混匀并离心后，将体系置于冰上预冷。 3️⃣ 加样时，注意吸一打二的原则，加mix时同引物组可不换枪头，但加cDNA时每个孔需换一次枪头。 4️⃣ 加样完成后，用专用的膜封好，再用保鲜膜包裹。 5️⃣ 以8000rpm的速度离心3分钟，去除气泡。 6️⃣ 根据自己的需求设置程序，然后上机运行。 7️⃣ 结束后，导出数据并进行分析。 𐟓Š **数据分析**：在获得数据后，你需要进行一系列的分析工作： - 检查MeltCurve是否为单峰且光滑。 - 确保ct值在1c9值范围内，且组内差距在0.3-0.5之间。 - 内参ct值应在18-20之间，目的基因ct值应在25-35之间（大于35的ct值可视为不可用）。 - 检查扩增曲线是否到达平台期且是否光滑。 - 如上述条件均满足，即可使用Excel进行进一步分析。 𐟔젧Ž𐥜诼Œ你已经掌握了RT-qPCR实验室操作的全流程！赶快动手试试吧！

qpcr数据作图 1️⃣ 样品纯化与污染控制：确保样品纯净，避免交叉污染。避免在打开EP管盖时产生气溶胶，手套不要触碰管帽内壁，并定期更换手套。扩增前后实验区域分离，不要在扩增前区域打开扩增后的EP管。 2️⃣ 扩增条件优化：调整镁离子浓度、引物设计、模板质量（包括抑制剂）、循环数、缓冲成分、酶浓度以及其他PCR添加剂或增强剂，以获得最佳扩增效果。 3️⃣ PCR体系设置：由于real-time qPCR的灵敏度高，每个样品至少设置3个平行孔，以确保数据分析的准确性。一般使用2㗧š„real-time qPCR MasterMix浓缩液，只需加入模板和引物即可。MasterMix应避免反复冻融，如果频繁使用，最好溶解后放在4℃保存。 4️⃣ 数据分析与统计：确保Ct值差异较小且标准差（SD）不大，以便进行统计分析。 5️⃣ 实验设计与重复：进行实验时，确保每个条件至少重复三次，以提高结果的可靠性。 6️⃣ 引物设计：选择合适的引物序列，确保引物的特异性和效率。 7️⃣ 模板质量：使用高质量的模板DNA，避免抑制剂的存在。 8️⃣ 酶浓度：调整酶浓度，找到最适合的酶量。 9️⃣ 缓冲成分：选择合适的缓冲液成分，以优化PCR反应。 𐟔Ÿ 镁离子浓度：调整镁离子浓度，以获得最佳的PCR反应条件。 1️⃣1️⃣ 循环数：根据实验需求调整循环数，以达到最佳扩增效果。

实验室小技巧：如何精确处理小体积样品嘿，实验室的小伙伴们！𐟑‹ 你们是不是经常在做Q-P实验，或者准备开始学习Q-P？如果是的话，你们一定知道精确加样的重要性！尤其是在96孔板或384孔板中，精确地吸取和加入样品是关键。 PCR反应体系中，常常需要1ul这样小的体积，甚至有时候稀释抗体时，需要吸取0.5ul的体积。所以，今天我来分享一些小技巧，帮助你们更精确地处理这些小体积样品。选择合适的移液枪 𐟔슩斥…ˆ，选一个量程合适的移液枪。一般来说，10ul或20ul的移液枪就够用了。不过，如果你需要更精确的体积，比如0.5ul，那就需要一把能精确到0.1ul的移液枪，比如吉尔森的MyPipetman。调整到精确的体积 𐟓 很多移液枪的最小量程是1ul，但有些高端的移液枪可以精确到0.1ul。调整到你需要的体积后，一定要再次确认。特别是对于小体积的样品，任何小小的变动都可能导致实验失败。吸取样品后再次检查 𐟔 吸取样品后，再次查看枪头是否吸到了样品，同时留意下调的体积是否有变动。有时候手抖或者碰到其他东西，都会导致体积变化。特别是吉尔森的MyPipetman，有量程锁功能，锁上后纹丝不动，大大减少了人为误差的可能性。加样时贴着侧壁 𐟒犥𐏤𝓧篧š„样品容易挂在壁上，所以加样时尽量贴着侧壁。这样你可以看到一个小水珠，这样很直观，可以避免少加和重复加。希望这些小技巧能帮到你们，让你们的实验更加顺利！如果有其他问题或者经验分享，欢迎留言哦！𐟒쀀

𐟧챐CR实验全攻略𐟔슰Ÿ” 提取RNA是qPCR的第一步！ 1️⃣ Trizol裂解法让细胞或组织充分裂解，冰上静置后进行下一步。 2️⃣ 氯仿萃取，分离RNA和其他成分，离心后轻拿轻放，避免混匀。 3️⃣ 异丙醇沉淀RNA，冰上静置后再次离心。 4️⃣ 用75%乙醇洗涤沉淀，去除杂质，然后干燥溶解RNA。 5️⃣ 使用Nano核酸分析仪检测RNA浓度和纯度。 𐟒ᠦŽ夸‹来，将RNA逆转录为cDNA！ 1️⃣ 用DEPC水清洗紫外分光光度计平台。 2️⃣ 检测各样品浓度，确保RNA吸光度（260/280）为2。 3️⃣ 去除基因组DNA，加入逆转录酶进行逆转录。 𐟔堦œ€后，进行q-PCR实验！ 1️⃣ 准备q-PCR体系，包括SYBR qPCR Master Mix、引物和稀释后的Template cDNA。 2️⃣ 进行q-PCR反应，检测基因表达情况。 𐟎‰ 完成整个qPCR实验流程，轻松掌握基因表达情况！记得做好实验记录和数据分析哦！𐟌Ÿ

PCR反应体系详解：从引物到酶的选择 PCR反应的核心是扩增缓冲液、dNTP混合物、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶和Mg2+。以下是详细的介绍：引物 𐟧슥𜕧‰馘R反应的关键，决定了扩增的特异性。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就可以设计出互补的寡核苷酸链作为引物，从而在体外大量扩增模板DNA。设计引物时需要遵循以下原则：长度：15-30bp，常用20bp左右。扩增跨度：200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 G+C含量：40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免内部二级结构和引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 𐟌€ 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP混合物 𐟧ꊤNTP混合物包括四种碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），各200umol/L。模板DNA 𐟓œ 模板DNA的量通常在0.1～2ug之间。 Mg2+ 𐟌 Mg2+的浓度通常为1.5mmol/L。反应体系 𐟏튥𐆤𘊨🰦‰€有成分加双或三蒸水至100ul，即可进行PCR反应。 PCR反应的五要素包括引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，每个要素的选择和浓度都至关重要，直接影响PCR的结果。

- 构建表达载体是分子生物学实验中的重要一步，以下是详细的步骤和注意事项：第一步：克隆目的基因 𐟧슩斥…ˆ，你需要克隆目的基因。虽然PCR反应看起来很简单，但很多人都会在这一步遇到问题。你的模板可能是质粒、cDNA或基因组DNA。PCR的结果取决于你使用的每个成分。首先，确保使用高保真酶，这样可以获得保真性强的基因。其次，引物设计要足够特异，长度可以稍长一些，建议一次设计多对引物，因为不一定一次就能成功。第二步：PCR体系与纯化 𐟧𜊥𛺨…ˆ用50的PCR体系，使用大孔胶跑条带并切胶回收。你的目的基因条带必须单一且长度正确，然后进行切胶纯化。不要嫌麻烦，因为这会影响后续连接到克隆载体的步骤。纯化后，别忘了测一下浓度，虽然浓度会比原先低，但问题不大。第三步：连接到克隆载体 𐟔— 将目的基因连接到克隆载体上是很重要的一步。每个实验室使用的克隆试剂盒可能不同，有的用T载，有的用B.zero。按照说明书操作即可。这一步必不可少，因为你的目的基因还没有经过测序，不能直接连接到表达载体上。克隆载体一般使用通用引物，操作方便。很多同学为了省事，直接将目的基因连接到表达载体上，这样后续可能会出现问题。第四步：转化大肠杆菌 𐟦 转化大肠杆菌是一个常规操作。市面上有很多品牌的大肠杆菌感受态细胞。使用时必须严格按照说明书操作，避免反复冻融。刚刚好融化时加入载体转化效率最高。第五步：筛选阳性克隆 𐟔 筛选阳性克隆是常规操作，具体步骤不再赘述。第六步：测序验证 𐟓Š 将提取的质粒进行PCR并送去测序，看看是否与你的目的基因相符。即使长度一致，也不一定是你想要的基因。第七步：连接到表达载体 𐟚€ 最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。设计的引物和使用的连接方法有直接关系。最简便的方法是同源重组。如果使用同源重组方法，用同源臂引物PCR克隆载体。表达载体需要提前进行酶切线性化，推荐双酶切线性化，这样连接效率会更高。按照说明书操作即可，后续的转化大肠杆菌等步骤与之前相同。希望这些步骤能帮助你顺利构建表达载体！如果有任何问题，欢迎留言讨论，大家一起进步！

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

𐟧접PCR的魔法原理揭秘 ✨ 𐟔 你是否好奇QPCR是如何运作的？今天，我们就来揭开这个神秘的面纱！ 𐟌᯸ PCR，即聚合酶链式反应，是一种以DNA为模板，在DNA聚合酶的帮助下，体外合成DNA并不断扩增的过程。而QPCR，即定量PCR，是在PCR体系中加入了荧光染料或荧光探针，通过实时检测荧光信号来监测PCR进程。 𐟒᠑PCR的原理是这样的：在PCR反应中，随着DNA的复制和扩增，荧光信号会逐渐增强。通过检测这个荧光信号的变化，我们可以知道DNA的复制情况，从而对模板进行定量的分析。 𐟓 QPCR的流程包括：RNA提取、逆转录、引物设计、选择内参、模板用量和对照设置等步骤。每一个步骤都至关重要，确保了实验的准确性和可靠性。 𐟌Ÿ 通过QPCR，我们可以更精确地了解基因的表达情况，为生物研究和医学诊断提供了强大的支持！现在，你是不是对QPCR有了更深入的了解呢？

超净工作台紫外灯使用全攻略 𐟌Ÿ 菌落PCR与摇菌全流程 1️⃣ 准备工作打开超净工作台，启动紫外灯进行灭菌20~30分钟。将枪头、酒精灯、离心管等放入超净工作台，确保无菌环境。 2️⃣ 配制PCR预混液根据所需菌落数量，计算并配制PCR体系。例如，若要验证16个菌，可先配制20ul体系，再分装至八联管中。 3️⃣ 挑取菌落用10ul枪头轻轻沾取菌落，注意不要沾太多。将沾有菌落的枪头放入PCR预混液中，反复吹打后弃去枪头。 4️⃣ PCR反应将混合好的PCR液体放入PCR仪中进行反应。反应完成后，进行跑胶验证条带大小是否正确。 5️⃣ 摇菌流程将离心管架、50ml离心管、液体培养基LB、枪头等放入超净工作台，再次进行紫外消毒。根据挑菌数量，摆放相应的50ml离心管，并加入5-10ml LB和对应抗生素。打开培养皿，挑选PCR正确的菌落，用白色枪头挑菌，放入离心管中反复吹打后弃去枪头。将离心管放入摇床继续培养，第二天可进行保菌、提质粒或送测。 𐟌Ÿ 超净工作台操作注意事项所有操作均在超净工作台中进行，确保无菌环境。使用紫外灯时，注意安全，避免直视灯光。操作过程中，保持手部稳定，避免污染。

𐟔젨🞦Ž娽쥌–的实验步骤大揭秘！𐟔 𐟓š 想要了解连接转化的步骤吗？这里为你详细揭晓！ 1️⃣ 扩增目的序列：首先，进行目的序列的扩增，使用50微升体系进行胶回收或产物回收。 2️⃣ 连接反应：采用无缝克隆技术，使用T4连接酶，按照说明书进行连接反应。连接体系如图所示。 3️⃣ 短暂离心：将混合物短暂离心，确保所有成分混合均匀。 4️⃣ 孵育：将混合物放入PCR仪，37℃孵育30分钟。在此期间，可以准备超净台、水浴锅和解冻感受态细胞。 5️⃣ 感受态细胞处理：将50感受态细胞与5目的序列回收产物混合，使用移液枪轻柔搅匀。 6️⃣ 水浴激活：将混合物放入42℃水浴中90秒，然后迅速冰浴2分钟。 7️⃣ 复苏细菌：加入800预热的液体培养基（LB），放入37℃摇床，220r，孵育1小时。 8️⃣ 离心收集：7500rmp离心1分钟，吸取600上清液弃去，剩余菌液重悬。 9️⃣ 平板涂布：将重悬菌液涂布在含有玻璃珠的平板上，封板后37℃培养12-20小时。 𐟔Ÿ 观察结果：培养完成后，观察平板上的菌落生长情况，以确认连接转化是否成功。 𐟒ᠦ𘩩樦示：在进行实验前，请确保所有仪器和材料都已准备好，并按照步骤逐步操作，祝你实验顺利！

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