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qpcr原理权威发布_rt-qpcr原理(2024年12月精准访谈)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：观点更新日期：2024-11-30

qpcr原理

qPCR实验全流程详解，轻松搞定！ 𐟎‰ 详细讲解qPCR实验的原理和步骤，助你轻松掌握！一、实验步骤： 1️⃣ 提取核酸：从目标样本中提取DNA或RNA。 2️⃣ 反转录（针对RNA样本）：将RNA转录成相应的cDNA。 3️⃣ 预处理：纯化提取的DNA/cDNA，去除污染物。 4️⃣ 设计引物和探针：设计特异性引物和荧光探针，与目标序列特异性结合。 5️⃣ 准备反应体系：按照说明书要求，配制引物、探针、模板、聚合酶、缓冲液等。 6️⃣ 执行PCR循环：将反应体系装入热循环仪并进行PCR循环。检测DNA变性、引物结合、扩增和荧光信号等。 7️⃣ 数据分析：根据荧光信号的变化，分析Ct值，计算目标序列的相对数量。二、qPCR原理： qPCR（Real-time Quantitative PCR）即实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR），在PCR过程中加入荧光基团，根据荧光信号的变化实时监测扩增产物的变化。并通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。实时荧光PCR的产物不同，主要方法分为三种： 1️⃣ DNA结合染料法：与双链DNA小沟结合的荧光染料，不与单链DNA结合，与双链DNA结合会发出荧光，从而进行实时监测。 2️⃣ 探针化学法：荧光标记的探针与靶序列特异性结合产生荧光信号，利用荧光信号实时检测PCR扩增产物的变化。 3️⃣ 淬灭染料引物法：使用荧光标记引物扩增，使荧光标记基因掺入到PCR扩增产物中，从而利用荧光能量共振进行传递。 𐟓š 篇幅有限，完整电子版请自行获取～

𐟔젧𛆨ƒž实验全攻略：从基础到高级技巧 𐟓š 细胞培养指南 𐟌𑠧𛆨ƒž复苏 𐟧Š 细胞冻存 𐟔„ 细胞传代 𐟒‰ 全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质 𐟏ž️ 组织块贴壁法培养大鼠平滑肌细胞 𐟔젥…疫组化（IHC）实验 𐟧ꠥ…疫组化实验指导 𐟓Š 结果分析.wmv 𐟓Š 如何量化IHC染色 𐟌€ 流式细胞术 𐟌 流式细胞技术 𐟓Š 流式细胞术在生命科学领域的应用 𐟓Š 流式基础原理 𐟓Š BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册 𐟓Š BD FACSAria II用户指南 𐟔젗estern blot实验 𐟧𜠗estern blot原理和详细操作步骤 𐟧𜠨𝬨†œ液配方 𐟧𜠥𐁩—�𒩅方 𐟧𜠦˜𞨉𒦶𒩅方 𐟧𜠤𘀦Š—液配方 𐟧𜠤𚌦Š—液配方 𐟧𜠔BST配方 𐟔젱PCR实验 𐟧젱PCR原理和方法 𐟧젨𝬥𝕨š合酶链式反应(RT-PCR) 𐟧젥—𖨍祅‰定量PCR的三种数据分析方法 𐟧젤𛎒NA提取到RT-PCR.WmV 𐟧젹mvkt-PCR技术实验指南 𐟔젧𛆨ƒž克隆形成实验 𐟏�𛆨ƒž克隆形成实验.pdf 𐟏�ˆ†子生物学实验手册.pdf 𐟏�ranswell实验.pdf 𐟏�ˆ’痕实验.pdf 𐟔젥…𖤻–细胞实验技巧 𐟧ꠃCK-8细胞实验 𐟧ꠅLISA实验原理总结

qPCR原理与步骤详解，一文搞懂！ 𐟔 qPCR，即定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction），是一种在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过实时监测荧光信号的增强来定量分析起始模板的方法。其核心原理是利用荧光信号的变化实时监测PCR反应过程，其中荧光染料通常与双链DNA结合，随着DNA的合成，荧光染料被释放出来，产生荧光信号。 𐟓ˆ 用途：基因表达分析：测量特定基因的mRNA水平，了解基因表达的调控。病原体检测：检测和定量病原体DNA，如病毒或细菌。遗传突变分析：识别和定量基因突变或单核苷酸多态性（SNPs）。基因拷贝数变异：检测基因拷贝数的变化，与某些遗传疾病相关。克隆验证：验证克隆DNA片段的插入和表达。 𐟔젥ꌦ�꤯𜚊初始模板DNA的准备：首先，需要从样本中提取DNA或RNA，对于RNA样本,还需要进行逆转录步骤,将其转换为cDNA。反应体系的构建：将模板DNA、特异性引物、荧光染料或探针、DNA聚合酶和PCR反应缓冲液混合在一起。 PCR扩增过程：在q-PCR仪中进行循环扩增，包括变性（高温使DNA双链分离）、退火（低温使引物与目标序列结合）、延伸（中温进行DNA合成）三个步骤。荧光信号的实时监测：在PCR扩增过程中，荧光染料或探针的荧光信号会随着扩增的进行而增强。荧光染料如SYBR Green1可以结合到所有双链DNA，而荧光探针则只有在与目标序列特异性结合后才会发出荧光。阈值和Ct值的确定：在扩增曲线的指数增长区设定一个荧光阈值，Ct值（阈值循环数）是指达到该阈值时的循环圈数。Ct值与起始模板DNA的量成反比。标准曲线的制作：通过已知浓度的标准品进行梯度稀释，得到一系列扩增曲线，根据Ct值与起始模板量的对数值之间的线性关系，制作标准曲线。定量分析：将未知样本的Ct值代入标准曲线，计算出样本中目标序列的起始模板量,实现定量分析。数据的分析和解释：最终，通过软件对收集到的数据进行分析，包括熔解曲线分析以验证特异性，以及定量结果的解读。 𐟓Š 通过这些步骤，qPCR能够精确地测量特定基因的表达水平、检测病原体、分析遗传突变以及验证克隆插入等。

qPCR原理详解：实时荧光定量PCR 大家好，今天我们来聊聊qPCR（定量多聚酶链式反应）的原理。最近有点抑郁，加上药物作用，每天睡12小时，实在没精力更新。不过还是感谢大家的支持，下周有流式实验，到时候会拍操作界面的照片给大家详细讲解。 qPCR和传统PCR的主要区别在于检测方式。传统PCR只是对基因进行扩增，而qPCR则是实时检测底物的荧光强度来判断mRNA的表达量。这就引入了一个重要的概念：Ct值。在qPCR中，基因的表达与荧光强度并不是线性关系，而是指数级增长（因为DNA的扩增是2^n次方）。因此，在某个循环时，荧光强度会达到一个阈值。当荧光强度超过这个阈值时，我们认为是高表达。到达这个阈值需要的循环数越少，基因的表达量就越高。这就是图2中曲线含义的解释（图片来源：Merck）。有人可能会问，既然是mRNA的表达量，为什么说是DNA的扩增呢？这就要提到mRNA和cDNA的概念。空气中存在RNA酶，所以RNA在正常条件下极不稳定。即使是RNA-seq，也需要将RNA逆转录为cDNA。在生物学中，我们一般认为这两者的表达是一致的。篇幅有限，下次再讲操作流程（RNA提取和引物设计等）。感谢大家的支持。

qPCR基础知识大揭秘：你真的了解吗？ 𐟓Œ PCR基础概念： PCR（聚合酶链式反应）：这是一种分子生物学技术，用于放大和扩增特定的DNA片段。可以理解为在生物体外进行DNA复制。PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 RT-PCR（逆转录PCR）：是PCR的一种广泛应用的形式。RNA通过逆转录成互补DNA（cDNA），然后以cDNA为模板进行扩增。 qPCR（实时荧光定量PCR）：在PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料，实现定量功能的技术。 real-time RT-PCR（实时逆转录PCR）：结合了荧光定量技术的逆转录PCR。 ⚠️ 注意：Real-time PCR和逆转录在国际上通常分别缩写为qPCR和RT-PCR。实验室中，qPCR通常指的是RT-qPCR，用于研究RNA表达量的变化。 𐟓Œ 实时荧光定量PCR的荧光物质：染料法：如SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的绿色激发波长的染料。荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以通过荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA数量。 𐟓Œ qPCR原理：随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 𐟓Œ qPCR扩增曲线阶段：基线期：初始阶段，荧光信号较弱。指数期：荧光信号迅速增加。线性期：荧光信号增加速度减慢，但仍保持线性增长。平台期：荧光信号增加速度减慢至接近停滞。字数有限制，更多内容请继续关注更新。

CHIP实验全解析，轻松搞定！ 𐟔젥ꌥŽŸ理 ChIP（染色质免疫沉淀）实验的原理是在细胞生理状态下，将DNA与蛋白质交联，然后通过超声或酶处理将其随机切断成一定长度的染色质小片段。利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白结合的DNA片段沉淀下来，再通过特异性富集、纯化和检测这些片段，从而获取蛋白质与DNA相互作用的信息。 𐟓Š 适用范围研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用；研究目的蛋白与整个基因组未知序列的相互作用；研究一个目的蛋白与DNA的相互作用；研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；研究启动子区域的组蛋白修饰；研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。 𐟌Ÿ 实验优势能够检测启动子DNA与其天然基因组状态下的转录因子间的相互作用；能够检测组蛋白编码（如组蛋白乙酰化、三甲基化等）和离散染色质区域的转录因子翻译后修饰；最大限度地减少制备和沉淀过程中染色质重排的机会；基因特异性引物可用于后续PCR检测，增加特异性。 𐟓ˆ 实验流程完成染色质免疫沉淀后，可以对纯化的染色质及有关蛋白、组蛋白、转录因子和辅因子进行多种下游分析。最常见的分析方法有ChIP-qPCR和ChIP-seq等。CHIP实验技术流程图见图2。 𐟒ᠤ𛣥š服务我们提供CHIP-seq和CHIP-qPCR实验的代做服务，免费实验设计，全程博士解答，最终交付结果图和实验报告。欢迎随时咨询！

𐟔젧𛆨ƒž实验全攻略：从原理到步骤 𐟓š 细胞克隆形成实验：详细步骤与原理，让你轻松掌握。 𐟓Š qPCR实验：从原理到操作步骤，全面解析。 𐟌ˆ 免疫组织化学：原理和方法，助力你的科研探索。 𐟒ᠥˆ’痕实验：从实验设计到结果分析，一应俱全。 𐟌𑠧𛆨ƒž凋亡检测：流式细胞术的应用，揭示细胞凋亡的奥秘。 𐟓– 分子生物学实验手册：涵盖多种实验技术，提升你的实验技能。 𐟚€ Transwell实验：原理、步骤和注意事项，助你成功开展实验。 𐟌Ÿ 细胞实验技术手册：全面介绍细胞实验的原理和方法，提升你的实验水平。 𐟔젗estern blot实验：从原理到操作步骤，详细解析。

𐟔쥮ž时荧光定量PCR全解析𐟧슰Ÿ琤𝠤𚆨磥—𖨍祅‰定量PCR吗？这是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测的技术哦！ 𐟒᥮ž时荧光定量PCR，简称qPCR，不仅能定性判断DNA序列的有无，还能定量确定DNA的拷贝数。与常规PCR相比，它提高了检测灵敏度，引入了探针增加了反应特异性，并缩短了反应时间。 𐟔qPCR的原理是怎样的呢？在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光染料，随着反应进行，荧光信号强度增加。通过收集荧光强度信号，可以监测产物量的变化，从而得到荧光扩增曲线。 𐟓Š溶解曲线是qPCR的另一个重要考察指标。通过观察溶解峰和TM值，可以判断实验结果的特异性。 𐟒‰另外，qPCR还有绝对定量和相对定量两种方法。绝对定量是通过标准曲线来计算目标核酸分子的实际拷贝数；而相对定量则是通过比较不同样品中目标基因的表达变化来研究基因表达情况。 𐟔쥜覣€测方法上，qPCR可分为荧光染料法和荧光探针法。荧光染料法操作简便，但特异性较差；而荧光探针法具有高特异性和重复性，但需要合成探针，成本较高。 𐟚覜€后，还有一些常见问题需要注意哦！比如无Ct值出现可能是检测步骤有误或引物降解；Ct值重复性差可能是加样误差或模板量低；Ct值出现过晚可能是扩增效率低或PCR产物太长。遇到这些问题时，要及时调整实验条件或优化反应体系哦！

qPCR实验步骤详解：从原理到操作 𐟔젱PCR 扩增原理 qPCR，即定量PCR，是一种在PCR反应中引入荧光染料或探针的方法。通过实时监测荧光信号在整个PCR过程中的累积，最终利用CT值和标准曲线对未知样本进行定量分析。这种技术的高灵敏度、高效率和高精确性，使其在生物医学领域的基因表达分析、病原体检测以及基因定量研究中得到广泛应用。 𐟌ˆ 常用标记方法 SYBR Green：这是一种非特异性荧光标记方法。SYBR Green I是一种荧光染料，能与所有双链DNA结合。因此，荧光信号量与反应体系中的双链DNA含量成正比，荧光强度随产物增加而增加。但值得注意的是，由于染料与双链DNA结合具有非特异性，可能导致假阳性结果。优点：简单易行，成本较低，无需合成特异性探针。缺点：对扩增的特异性要求高，不能进行多重PCR。 TaqMan技术：这是一种特异性荧光探针方法。在PCR扩增过程中，除了引物外还会加入一种特异性的荧光探针。这种探针由寡核苷酸构成，5端标记有一个荧光报告基团（如FAM等），3端标记有一个淬灭基团（如TAMRA等）。探针完整时，5端的荧光基团发出的荧光会被3端的淬灭基团淬灭，导致不能发出荧光信号。但在PCR扩增过程中（尤其是在延伸阶段），Taq酶的5'→3'外切酶活性会降解探针，使报告基团和淬灭基团分离，从而使得5端荧光物质释放出来，并产生荧光信号。优点：特异性强，能进行多重PCR。缺点：需要设计特异性探针，成本较高；有时探针设计困难。 𐟧ꠤ𚧧‰饤„理步骤待仪器扩增完成且冷却后，打开仪器舱门或滑开盖子。结果分析完成后，才取出扩增产物。如果需要立即进行下一个实验，应检查本次实验结果是否存在异常曲线。若发现异常曲线，需要观察异常曲线位置以及相应反应管中扩增物的状态，初步排查可能的原因，如试剂蒸发或分液不均等。取出产物时需要检查是否有反应管爆裂或松动，应该尽量捏住反应管壁而非管盖，以防在取出过程中管盖脱落。避免随意丢弃扩增产物，应先将其装入密封袋中，再丢入指定的垃圾桶。

rt-pcr 𐟓š PCR（聚合酶链式反应）：原理：通过变性、退火、延伸三个步骤，将目标DNA片段指数级放大。用途：常用于DNA的扩增、检测、克隆等。局限性：只能检测DNA，无法直接检测RNA；无法定量初始模板量。 𐟓š RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）：原理：先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用cDNA作为模板进行PCR扩增。用途：主要用于RNA的定性和定量分析，比如检测基因表达水平。局限性：无法定量初始模板量。 𐟓š qPCR（实时定量PCR）：原理：通过荧光染料或荧光探针，实时监测PCR反应中扩增产物的增加，根据荧光信号的强弱和循环数，计算起始模板的拷贝数。用途：高灵敏度和高特异性地检测基因表达水平、病原体数量等。特点：定量准确，重复性好。 𐟓š RT-qPCR（逆转录实时定量PCR）：原理：先将RNA逆转录成cDNA，然后对cDNA进行实时定量PCR。用途：主要用于RNA的定量分析，比如检测基因表达水平、病毒载量等。特点：结合了RT-PCR和qPCR的优点，既可以检测RNA，又可以定量。 𐟓Š 总结： PCR：扩增DNA的通用技术。 RT-PCR：将RNA转录为cDNA后进行PCR。 qPCR：在PCR过程中实时定量。 RT-qPCR：将RNA逆转录为cDNA后进行实时定量。 𐟔 选择哪种技术主要取决于实验目的：检测DNA：使用PCR即可。检测RNA：需要先进行逆转录，即RT-PCR或RT-qPCR。需要定量：选择qPCR或RT-qPCR。 𐟒ᠦ示：RT-PCR和RT-qPCR的区别在于是否进行实时定量。

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