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提质粒最新娱乐体验_提质粒步骤及原理(2024年11月深度解析)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：话题更新日期：2024-11-30

提质粒

高效提取质粒的详细步骤指南𐟧슨𔨧𒒦取的原理：基因组DNA在碱性条件下变性后无法恢复原有构象，而质粒DNA则能在加酸恢复中性后恢复构象。我们利用这一差异来提取质粒。 1️⃣ P1菌体裂解 P1菌体通常保存在-4℃冰箱中。使用含有氢氧化钠（NaOH）和十二烷基硫酸钠（SDS）的混合溶液处理细菌，导致细胞壁和细胞膜破裂，释放出质粒DNA和宿主细胞的基因组DNA。其中还含有RNA酶，可以有效去除RNA。 2️⃣ P2DNA变性在碱性条件下（pH 12.0-12.5），质粒DNA和宿主细胞的染色体DNA都会变性，但质粒DNA由于其较小的分子量和超螺旋结构，变性后仍能保持紧密的缠绕状态。加入P2后要轻轻上下摇晃8-10下，以免过度变性，无法高效提取质粒。 3️⃣ P3/E3DNA复性当加入中和液（如乙酸钾）后，溶液的pH值恢复中性，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，而宿主细胞的染色体DNA复性缓慢，形成大的复合物。此步骤一定要剧烈上下颠倒8-10次，使质粒DNA充分接触中和液，不然提取的质粒浓度会很低。 4️⃣ 离心分离在离心过程中，由于质粒DNA分子较小且复性迅速，它们会留在上清液中；而蛋白质与细菌基因组DNA由于缠绕形成絮状沉淀，在离心时会被沉淀下来。所以此步骤留下的是上清，剩下的就都是去上清啦。 5️⃣ PW 质粒纯化上清液中的质粒DNA可以特异性地吸附到柱子上，通过漂洗将非特异性吸附的杂质洗掉，得到纯化的质粒。 6️⃣ 洗脱液或ddH20洗脱将吸附在柱子上的质粒DNA洗脱下来，得到高纯度的质粒。一般吸取100-200ul即可，最后记得测浓度！第一次使用黄色柱子，第二次使用白色柱子，千万不要弄混，根据说明书使用即可。

分子克隆全攻略：从原理到操作分子克隆是生物学研究中的一项关键技术，主要用于分离、纯化和扩增特定的DNA片段。以下是分子克隆的主要步骤和原理：质粒提取 𐟌 碱裂解法：利用共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5的条件下，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，而共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。 PCR 𐟔슨š合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：目的是在体外扩增特定的DNA条带。高温变性（Denaturation）：双链DNA在高温下变性，双链打开变成单链。低温退火（Annealing）：引物与模板DNA互补区结合。适温延伸（Extension）：模板DNA-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则和半保留复制原理，引物沿着5'→3'的方向合成新的DNA链。 PCR产物纯化/胶回收 𐟧𜊧滥🃦Ÿ𑦳•：大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA，使得DNA双链变单链，不会被生物大分子溶剂洗脱，但能经水溶性缓冲液水化后，被定量回收，从而实现纯化分离。转化 𐟦 感受态细胞：指细菌在一定的生长阶段，能够吸收外来DNA的状态。转化是指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。原理：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。菌落PCR 𐟏𚊥ŽŸ理：这是一种用单个菌作为模板的鉴定方法，可以快速检测菌落是否为含目的质粒。希望这些信息能帮助你更好地理解分子克隆的原理和操作步骤，祝你在科研道路上顺利前行！

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

质粒提取常见问题解答𐟌€𐟌€ 在质粒提取过程中，我们可能会遇到各种问题。以下是一些常见问题的解答：如何确定质粒小抽的细胞用量？⬇️ 在一般的载体构建实验中，几微克的DNA就足够了。因此，小提5ml菌液通常能满足需求。如果使用过多的细胞，由于试剂盒的限制，可能会导致菌液难以裂解，而且DNA的纯度和得率也不会显著提高。对于需要大量质粒的情况，可以考虑更换提取试剂盒或按比例增加各溶液的用量。电泳分析抽提的质粒会看到什么？𐟌Š 如果质粒的纯度很差，电泳加样孔往下看到的条带依次是基因组DNA、开环环状质粒、超螺旋质粒、变性的超螺旋质粒和细菌RNA。高质量的质粒胶图主要部分为超螺旋质粒，没有RNA等污染。质粒制备的得率由哪些因素决定？𐟌𑊨𔨧𒒧š„得率受多种因素影响，包括宿主细胞类型、大肠杆菌的数量、质粒的拷贝数和提取过程中使用的纯化方式（试剂盒类型）。质粒需要什么样的纯度？𐟔 对于一般的载体构建和测序检测，手工和试剂盒制备的DNA就能达到要求。但如果质粒用于细胞转染实验，则需要无热源、无内毒素的质粒。为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？✂️ 主要原因是在提取质粒的过程中产生了变性的超螺旋质粒，限制性内切酶无法对其进行酶切。因此在判断酶切效果时，变性的超螺旋质粒常被误认为是酶切下来的片段，从而导致误判。可以通过在酶切后的电泳分析中增加一个原始质粒进行对照来避免误判。如何判定DNA的纯度和浓度？𐟓 使用试剂盒抽提的质粒DNA，可以通过仪器检测OD260和OD280浓度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之间。1 OD260=50/ml。如果要估算质粒浓度，建议通过琼脂糖电泳来判断会更准确一些。为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？⏳ 主要原因可能是核酸酶的污染。除了在质粒提取过程中带入核酸酶外，质粒宿主细胞的种类也会影响到抽提质粒的质量。如果提取的质粒需要长期保存，可以使用内含丰富核酸酶活性的大肠杆菌，如DH5€DH1等。

中量质粒提取，关键步骤！在分子克隆实验中，质粒的质量至关重要，它直接影响后续实验的效果。今天，我们来探讨如何使用EndoFree Plasmid Midi Kit进行中量提取/制备质粒，并分享一些关键步骤和注意事项。 𐟔 Part I: 准备工作确认P1溶液中已加入RNase，并记得及时放回4度保存。加入buffer P1后，用vortex充分混匀，确保菌块完全裂解。加入buffer P2后，温和混匀，避免打断基因组DNA。加入buffer E3后，立即混匀，防止局部沉淀。 𐟔 Part II: 激活与洗涤使用去内毒素的试剂盒，避免内毒素影响细胞实验。激活柱子，确保Buffer PW中已加入指定体积的100%乙醇。建议用Buffer PW再多洗涤一次，确保质粒纯净。 𐟔 Part III: 洗脱与预热将灭菌蒸馏水提前预热至60度，提高洗脱效率。去除吸附柱中残留的乙醇，以免影响后续酶促反应。建议分两次洗脱，以提高洗脱效率。 𐟑‰ 此外，建议在每一步的间隙为下一步做准备，比如捏管子做标记等，尤其是一天要提几百个质粒的情况。

手把手教你构建质粒载体嘿，大家好！今天我们来聊聊如何用质粒构建技术来搞定你的科研项目。作为一个科研小白，这个过程可能会让你有点头大，但别担心，我来帮你理清楚！第一步：双酶切 𐟔ꊩ斥…ˆ，你需要选择合适的酶切位点。这一步是整个过程的起点。常见的酶切体系是这样的：内切酶1：1 内切酶2：1 酶缓冲液：5（根据浓度）载体：2 ddH₂O：补齐到50 37℃酶切1小时。记得在酶切前算好量，先加ddH₂O，最后加内切酶。第二步：切胶回收 𐟧슩…𖥈‡完成后，你需要跑琼脂糖胶来鉴定酶切效果。配胶时注意选择合适的胶浓度，分子量越大，胶浓度越小。跑胶完成后，紫外灯下一般会有两段，分别是载体和切下来的片段。根据结果进行胶回收，注意切下来的片段不回收。胶回收完成后测浓度备用。第三步：连接 𐟔— 插入片段可以根据自己的实验选择，通常可以通过PCR获得，或者是由三方公司合成的序列。在连接开始前，也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下：酶切后的载体：25ng 插入片段：1 T4 ligase buffer：1 T4连接酶：1（根据浓度） ddH₂O：补齐至10 16℃连接4小时以上或过夜。记得加入载体和插入片段的量由说明书得来，加样前计算好量，先加ddH₂O，最后加连接酶。小tips：为确保连接的顺利进行，务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用，不能混用。第四步：转化 𐟦 进行转化时，根据载体说明书选择合适的感受态细胞，常用DH5€‚同时仔细阅读感受态细胞说明书，看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。第五步：挑取单克隆 𐟧𘊦졦—妗餸Š，挑取单克隆，推荐至少选择两个及以上。第六步：摇菌 𐟍𚊦‘‡菌时，注意拧松菌管的盖子或者使用封口膜，倾斜放入恒温（一般为37℃）摇床，摇菌时间8小时为宜。第七步：提质粒送测序 𐟧슦‘‡菌完成后进行质粒提取，测浓度后送测序。注意这里会有部分说明书推荐选择新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定，这也是一种鉴定方式，可以根据酶切片段的大小来判断重组是否正确，但是最终确定还是推荐进行测序。第八步：保菌 𐟧Š 对测序正确的菌株进行保菌，并提质粒进行后续实验。小贴士 𐟒ከ𔨧𒒦ž„建方法多种多样，小伙伴们也可以选择同源重组的方法进行哦！希望这些步骤能帮到你，祝你的科研之路顺利！

质粒提取全攻略：从摇菌到纯化，轻松搞定！嘿，科研小伙伴们！今天我要给大家分享一下质粒提取的全过程，从摇菌到纯化，每一步都详细到让你轻松上手！𐟑颀𐟔찟窊 𐟔젦‘‡菌培养：首先，你需要一个经过鉴定的克隆菌液。在LB固体平板上涂布，然后放入37℃恒温培养箱，耐心等待12-17小时，直到菌落清晰可见。准备好含抗生素的LB液体培养基，挑取单个克隆菌落，放入培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。 𐟌€ 收获细菌并裂解：离心扩增好的菌液，按照说明书重悬，转入1.5ml离心管中。使用质粒小量抽提试剂盒，按照说明书操作，轻松提取质粒。 𐟧젨𔨧𒒄NA的纯化：细菌裂解后，高速离心1分钟，彻底去除上清。按照试剂盒说明，加入溶液I、II、III，温和混合，离心分离，质粒就在上清中啦！ 𐟓 注意事项：确保每一步操作都无菌，避免污染。裂解时不要过于剧烈，以免破坏质粒。洗脱液的加入要准确，确保质粒完全溶解。

质粒提取失败？10个原因帮你找出问题在进行质粒提取时，未能成功提取质粒或质粒得率低的原因有很多。以下是可能的原因及解决方法：细菌老化 𐟕𐯸：培养的细菌可能已经老化，导致质粒提取失败。建议重新挑选新菌落进行液体培养。细菌培养物生长过度 𐟌𑯼š细菌培养物在37℃下培养超过16小时，或者长时间存放培养物，都会影响质粒的提取。质粒拷贝数低 𐟓‰：使用低拷贝数载体可能导致质粒DNA提取量低。可以尝试更换为高拷贝数载体。菌体中无质粒 𐟚민š某些菌体本身不能在某些菌种中稳定存在，可能导致质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定。菌体过量，碱裂解不充分 𐟒导š取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分。可以减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量。溶液使用不当 𐟌᯸：裂解液和中和液在温度较低时容易出现盐析。如出现盐析，应将其放入37℃水浴至完全溶解、澄清。质粒未全部溶解 𐟧꯼š洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。乙醇残留 𐟍𖯼š洗涤液Ⅱ洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后，再加入洗脱液洗脱回收。洗脱液加入位置不正确 𐟓：洗脱液应加入吸附柱中膜的中央，以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表面，达到最大洗脱效率。洗脱效率 𐟌€：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。PH7.0-8.5之间，洗脱液用量不得小于50，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃水浴预热可以有效提高得率30%。通过以上方法，可以有效解决质粒提取失败或得率低的问题。希望这些建议能帮助你顺利提取质粒！

从零构建Gateway，挑战之旅！最近一个多月，我一直在尝试使用Gateway技术构建一个入门级的载体。这个课题是半路接手的，给我的引物非常复杂，对于完全没有分子克隆经验的我来说，一上手就是四千多bp的片段，真是有点手足无措。𐟘… 最初，我尝试了六个基因，但结果都不太理想。于是，我选择了两千多bp的片段，但依然没能成功。其他人告诉我，这个体系的成功率通常能达到百分之九十以上，这让我开始怀疑自己的实验能力。甚至老师亲自上手也没能成功，这让我既感到矛盾又有些松了一口气（既希望老师能成功，又不想被否定）。从一开始，我的菌落只长两三个，到后来重提质粒后，菌落数量增加了很多。我再次尝试两千多bp的片段，结果挑了七八十个克隆，都没有阳性克隆，甚至连非特异性条带都没有（至少四千多的片段还能看到非特异性条带）。现在，我遇到的关键问题是，使用Taq Rapid Polymerase无法从纯化回收的产物中扩增出条带。而选择了cDNA作为对照，却能扩增出条带，这让我非常困惑。𐟤” 总的来说，这段学习之旅虽然充满了挑战，但也让我对分子克隆有了更深入的了解。希望未来能有更多的突破和进展。

质粒提取及纯化实验全攻略𐟔슰ŸŒˆ 实验准备 LB培养基：蛋白胨：2g 酵母提取物：1g NaCl：2g 超纯水：200ml 将以上成分加入500ml锥形瓶中，调PH至7.5，封口后120摄氏度灭菌20分钟。灭菌准备：准备两个平板和试管，进行灭菌处理。灭菌后，待培养基冷却，加入200 Amp（氨苄，母液50mg/kg，稀释1000倍）。 𐟓… 操作步骤倒平板： LB培养基（50ml）+1.5%琼脂（0.75g），冷却后加入100 Amp。将培养基倒入50ml离心管中，每个平板约20ml。待平板凝固后，准备5个2ml离心管，每管1ml生理盐水。从-80度冰箱取出大肠杆菌菌液，用1ml枪头刮取菌液，依次稀释。涂布：用酒精灯热灭菌涂布棒，放凉。将平板底部在酒精灯周围烧一下，打开平板，用涂布棒推开菌液，以画圆形式涂布均匀。培养：将平板放入37摄氏度烘箱，倒置培养8小时左右。接菌：用枪吸2ml培养基到试管中，从平板中挑选单菌落，接种到试管中。放入37度震荡培养箱培养8小时，观察是否变浑浊。下午5-6点，浑浊后直接倒入锥形瓶中，37度震荡培养箱培养16-17小时。 𐟔砨𔨧𒒦取及纯化按照生工质粒抽提说明书操作，提取好的质粒去测浓度，并记录在管壁上。 𐟓 注意事项所有操作需在无菌房内进行。灭菌后待培养基冷却再加入Amp。涂布棒使用前需热灭菌并放凉。 𐟔젥ꌧ𛓦Ÿ 实验完成后，确保所有实验器材和物品都已清洁和消毒，以避免交叉污染。

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