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聚合酶最新娱乐体验_聚合酶链式反应(pcr)(2024年11月深度解析)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：话题更新日期：2024-11-28

聚合酶

NGS文库构建中的关键酶：一文全解 𐟔슎GS测序流程大致分为四个步骤：样本制备、文库构建、上机测序和数据分析。在实验过程中，酶的作用至关重要。今天，我们来聊聊文库构建中的关键酶。 DNA片段化：选择合适的酶很重要 ✂️ 首先，我们需要将大片段的基因组DNA片段化为小片段。目前市场上的测序仪测序长度通常在150-500bp之间，所以我们需要用机械打断或酶切打断的方法来实现。机械打断虽然有效，但操作复杂且损耗大。相比之下，酶切法成本更低，操作更简便。常用的片段化酶有两种：一种是基于转座子原理的Tn5转座酶，另一种是核酸内切酶的混合酶。这两种酶都能有效地将DNA片段化，为后续步骤打下基础。末端修复与加“A”：精细操作的关键 𐟔犊打断后的DNA会产生5'/3'黏性末端和平末端。在使用TA连接的方式进行接头连接时，DNA片段还需要5'端磷酸化和在3'端加“A”，才能与带“T”黏性末端的接头互补配对。这个过程由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶和Taq DNA聚合酶共同完成。 T4 DNA聚合酶：多功能酶的妙用 𐟌 T4 DNA聚合酶具有5'→3'DNA聚合酶活性，可以补平5'突出末端；同时，它也具有3'→5'外切酶活性，能够切平3'突出末端，将含黏性末端的DNA片段转变为平末端DNA。 T4多聚核苷酸激酶：磷酸基团的转移者 𐟚€ 由于人工合成的PCR引物、接头等5'端通常都是羟基基团而不是磷酸基团，因此需要T4多聚核苷酸激酶在ATP存在时催化ATP的磷酸基团转移到寡核苷酸链的5'端羟基末端上，为下一步连接接头做准备。 Taq DNA聚合酶：添加核苷酸“A”的能手 𐟏𗯸 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，可以从5'→3'方向合成DNA，同时它具有的脱氧核苷酸转移酶活性可以在PCR产物的3'末端添加一个核苷酸“A”。总结 𐟓 在NGS文库构建过程中，选择合适的酶至关重要。通过上述步骤，我们可以将大片段的基因组DNA片段化为小片段，并加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多的文库核酸分子，为后续的上机测序和数据分析打下基础。

RNA提取与逆转录详细步骤解析 𐟧ꠥꌥ€师整理，详细步骤，喂饭版。 𐟓Š 包括核酸分析及电泳，聚合酶链式反应（PCR）等。 𐟓Š 结果与意义分析 OD260/OD280比值在1.8-2.0为符合实验要求。 𐟔 出现问题与解决办法无RNA沉淀勾浆不完全：基因组DNA分子仍然很大，沸液粘润。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。沉淀不完全：从小于210动植物细胞、小于2m配动物组织、小于4m植物组织或RNA含量低的动植物组织中提取RNA时，勾体积太大，将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时，应按比例减少抽提溶液。 A260/A280比率小于1.65 分光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。分离的水样层中污染有苯酚层。终RNA没有完全溶解。 RNA降解从动物体取下的组织或细胞没有立即进行抽提或冰冻保存。水溶液或试管污染有RNA酶。 𐟧�€考题 TRIZOL法提取RNA如何避免DNA污染？凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。结果与意义分析 OD260值在1-R的比值18-2.0。因为蛋白质的吸光度值，如果溶液中有蛋白将会导致比值降低。所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA。 DNA电泳条带应该是整齐清晰，无拖尾或缺损的。变性胶电泳结果显示3条条带（28S、18s、和5s）为得到完整的RNA，且28s的亮度应为18s的两倍。出现问题与解决办法电泳条带模糊或弥散：更换电泳液、使用不含核酸酶的试剂、电泳后及时成像，电压适中。思考题用琼脂糖凝胶电泳分析核酸(DNA和RNA)有哪些影响因素？实验器材应一次性使用（枪头、PCR管）。注意操作环境，戴一次性手套。严格PCR操作规程。多次取样的试剂应分装。设置阴性对照和阳性对照。降低退火温度对反应有何影响？循环次数是否越多越好？为什么？ PCR技术可应用于哪些方面？举例？

PCR反应体系详解：从引物到酶的选择 PCR反应的核心是扩增缓冲液、dNTP混合物、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶和Mg2+。以下是详细的介绍：引物 𐟧슥𜕧‰馘R反应的关键，决定了扩增的特异性。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就可以设计出互补的寡核苷酸链作为引物，从而在体外大量扩增模板DNA。设计引物时需要遵循以下原则：长度：15-30bp，常用20bp左右。扩增跨度：200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 G+C含量：40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免内部二级结构和引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 𐟌€ 目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP混合物 𐟧ꊤNTP混合物包括四种碱基：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），各200umol/L。模板DNA 𐟓œ 模板DNA的量通常在0.1～2ug之间。 Mg2+ 𐟌 Mg2+的浓度通常为1.5mmol/L。反应体系 𐟏튥𐆤𘊨🰦‰€有成分加双或三蒸水至100ul，即可进行PCR反应。 PCR反应的五要素包括引物、酶、dNTP、模板和Mg2+，每个要素的选择和浓度都至关重要，直接影响PCR的结果。

图一，目前主要抗流感病毒药物。图二，特殊人群的抗病毒治疗。神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦等和聚合酶抑制剂巴洛沙韦等，是甲型和乙型流感的有效治疗药物。发病48 h内进行抗病毒治疗可减少并发症，降低病死率，缩短住院时间。发病时间超过48 h的重症患者依然可从抗病毒治疗中获益。妊娠期妇女首选奥司他韦进行抗病毒治疗。肾功能不全患者需依据肾功能调整药物剂量。老年人及合并基础疾病者属于流感并发症高风险人群，对疑似或确诊流感的患者，推荐尽快进行抗病毒治疗。参考《成人流行性感冒抗病毒治疗专家共识》北京ⷥŒ—京协和医院发热门诊

PCR模板的那些事儿 𐟧슐CR（聚合酶链式反应）的核心就是那个模板DNA。简单来说，这个模板就是我们要扩增的那段DNA的起点。它可以从各种来源提取，种类繁多，用途也各不相同。常见的PCR模板类型细胞DNA：直接从细胞里提取出来的DNA，可以用来扩增整个基因组或者特定的片段。 cDNA：通过逆转录反应把mRNA转成DNA，叫cDNA。它在研究基因表达和调控时特别有用，还能在PCR里扩增特定基因的编码区域。病原体DNA：来自细菌、病毒或者寄生虫的DNA，主要用于检测和诊断感染或者疾病。 DNA克隆：从重组DNA片段中分离出来的，可以用来扩增某个特定基因或者构建重组蛋白。遗传变异体：来自个体间遗传差异的DNA样本，用于研究单核苷酸多态性（SNP）或者突变。合成DNA片段：人工合成的DNA序列，用于构建重组蛋白、引导突变或者进行基因编辑。选择模板的小窍门在选择PCR模板时，得考虑目标DNA的丰度、纯度和起始浓度。通常来说，用高质量和高纯度的DNA样本可以提高PCR反应的特异性和效率。还要注意避免污染和降解，这些都会影响PCR的反应结果。总之，选对模板是成功的一半！希望这些小知识能帮你在PCR实验中少走弯路，早日出成果！𐟎‰

𐟧쩫˜通量测序的神奇原理✨ 𐟔Solexa测序：边合成边测序的魔力 Solexa测序法，一种单分子阵列测试技术，让你领略高通量测序的奥秘！首先，从细胞中提取DNA，随机打断并回收100-200bp的片段。这些片段经过接头连接，被精准地放置在测序玻璃片上。玻璃片上的序列与接头片段互补，实现原位扩增。在接下来的边合成边测序过程中，四种荧光标记的染料与聚合酶一同加入单分子阵列。通过酶的作用，荧光标记的核苷与引物结合，延伸单链DNA分子。利用生物发光蛋白，如萤火虫的荧光素酶，检测碱基加到引物后端时释放的焦磷酸盐信号。激光激发特定波长的荧光，CCD快速扫描并采集这些信号，从而确定每个碱基。 𐟒ᴵ4测序：焦磷酸测序的神奇之处 454测序技术，依靠生物发光进行DNA序列分析，展现了高通量测序的新高度！在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，每一个dNTP的聚合与荧光信号释放紧密相连。通过检测荧光信号的有无和强度，实时测定DNA序列。无需荧光标记的引物或核酸探针，无需电泳，快速、准确、灵敏度高且自动化！Roche GS FLX System就是基于这一原理的高通量基因组测序系统。四种碱基依次进入PTP板，发生碱基配对时释放焦磷酸。在酶的作用下，经过合成和化学发光反应，最终氧化荧光素并释放光信号。这些光信号被高灵敏度CCD实时捕获，从而准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

基因转录研究取得突破中国研究团队利用先进的显微技术捕捉到了基因转录过程中RNA聚合酶与DNA的相互作用，这一发现为基因表达的理解提供了新的见解。

DNA修复：精确度的秘密在上一章中，我们提到DNA修复主要依靠核酸酶校正，但这种方式的精确度并不够高。为了进一步提高精确度，DNA还需要其他几种修复方式。简单突变包括碱基替换（转换和颠换）、单个核苷酸的插入或缺失（点突变）。DNA修复的第一步是区分母链和子链。在大肠杆菌中，Dam甲基化酶可以标记母链中的A残基，位于5′-GATC-3′序列中。DNA聚合酶和连接酶等酶类也参与了DNA的修复过程。除了DNA复制本身的错误外，DNA损伤还可能来自环境因素，如辐射和诱变剂（mutagen），甚至是水。水解作用可能导致碱基脱氨基，从而引发非天然突变（即不正常的插入碱基）。为什么DNA含有胸腺嘧啶（Thymine）而不是尿嘧啶（Uracil）？因为如果DNA含有U而不是T，胞嘧啶（cytosine）的脱氨基作用将产生一个天然的碱基，修复系统无法识别。波长约为260 nm的辐射会被碱基强烈吸收，两个T容易聚合形成胸腺嘧啶二倍体（thymine dimer）。因此，晒太阳也要适度。 DNA修复有几种机制，其中剪切修补系统（excision repair system）以未受损DNA链为模板，可以将受损核苷酸或包含损伤的一小段单链DNA去除。重组修复（recombinational repair）是在DNA两条链都断裂时，以染色体姐妹单体为参考的修复，也称为双链断裂修复（double-strand break repair）。还有一种方式是当DNA聚合酶复制进程受到受损碱基阻碍时，移损聚合酶（translesion polymerase）以不依靠模板和新合成DNA链之间碱基配对的方式经过受损位点的拷贝。这种方式错误率高，是不得已而为之的下策。

分子实验中的RT到底是啥？𐟤” 在分子生物学实验中，RT 这个缩写可是个大咖，全称是 Reverse Transcription，也就是我们常说的逆转录。简单来说，这个过程就是用 RNA 作为模板来合成 DNA，方向和转录过程正好相反，所以叫逆转录。这个反应需要一种叫逆转录酶的催化剂来帮忙。 RT 的应用可广泛了，主要用在逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和荧光定量 RT-PCR（RT-qPCR）中。这些技术不仅在科研上大放异彩，还在临床诊断、药物研发等方面有着重要的应用。所以，下次看到 RT 这个缩写，你就知道它代表着逆转录啦！𐟘‰

组蛋白与非组蛋白：染色体的结构与功能组蛋白是一种与DNA结合形成染色体的蛋白质，主要由带正电荷的氨基酸组成，如精氨酸（Arg），属于碱性蛋白质。组蛋白基因是中度重复序列，在生物体中具有高度的保守性。组蛋白有五种类型：H1、H2A、H2B、H3和H4。H1形成核小体结构的连接丝，而其他四种组蛋白则形成核小体中心颗粒。DNA可以缠绕在组蛋白形成的八聚体上，组蛋白具有维持染色体形态、固定DNA以及降低DNA转录活性的功能。非组蛋白是染色质或染色体的组成成分，带负电荷的酸性氨基酸，包括RNA聚合酶、染色体骨架蛋白、调节蛋白以及参与核酸代谢和染色体化学修饰的相关酶类等。非组蛋白具有种族特异性，能够识别DNA的大沟部位，并通过氢键和离子键结合。非组蛋白的作用包括：形成染色体的支架部分，支撑染色体的形态，参与染色体的构建。调控DNA的转录活性。启动DNA的复制。通过这些功能，非组蛋白在染色体的构建和功能发挥中起着重要作用。