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二代测序原理权威发布_三代测序nanopore(2024年12月精准访谈)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：观点更新日期：2024-12-01

二代测序原理

分子发现的两大策略：筛与猜 𐟔 经典问题：老师，我该如何找到一个分子呢？ 𐟒ᠧ햧•夸€：筛选 𐟒ᠧ햧•夺Œ：猜测 𐟒𐠦œ‰钱就筛，没钱就猜 𐟓ˆ 提出问题 - 收集样本 - 高通量检测 - 候选分子 𐟒Ž 有钱筛分子的策略：检测mRNA的叫表达谱芯片检测miRNA的叫做miRNA芯片测lncRNA的叫做lncRNA芯片 𐟓œ 二代测序（NGS）：next generation sequencing 𐟔젥䧥䚦•𐧔襈𐧚„技术是三种：芯片、测序、质谱 𐟓Š 芯片检测DNA及RNA是碱基互补配对原理 𐟓ˆ 芯片检测蛋白是抗体-抗原特异性结合原理 𐟔젦ŠŠ探针密密麻麻设计在芯片上，对目的标本的DNA或者RNA进行杂交，显示荧光。 𐟓ˆ 芯片还有一个名字（Microarry微阵列），这个就比较形象了。用人肉眼看不清楚的一个微小的反应体系检测。 𐟓œ 二代测序（NGS）：next generation sequencing = deep sequencing 𐟓œ 一代测序（Sanger 测序） 𐟒ᠥ𛺨𜚊简单的表达谱分析可以芯片非编码RNA建议测序 𐟔젨𔨨𐱯𜈍ass spectrum） 𐟓Š 分子量和等电点是蛋白质分子的特点 𐟔 蛋白质的身份证：质荷比（离子质量和带电荷比值） 𐟔젨𔨨𐱥𐱦˜累碌奈𗨺뤻𝨯的设备 𐟔 筛基因、选DNA、RNA还是蛋白质好呢？答案：RNA 𐟔 因为DNA离蛋白隔了一个环节，并且DNA是遗传水平上变化，大部分疾病的变化都是表观水平，DNA检测不到。蛋白是功能的执行单位，但是蛋白不稳定，有半衰期，不能被及时捕捉到，样品处理也要求太高。所以常规来说从转录水平比较好，上可追溯基因改变，下可跟踪蛋白。PCR引物要比抗体省钱得多，所以实践中mRNA筛选更经济。

单细胞测序：谁更强？单细胞测序是一种基于二代测序（NGS）的方法，用于检测群体中单细胞的基因组、转录组、表观基因组和蛋白组，从而提供高分辨率的细胞间差异视图。其中，单细胞转录组测序（Single-cell RNA-Sequencing，ScRNA-Seq）最为常见。 Smart-seq和10x Genomics是两种重要的单细胞测序技术。Smart-seq采用全转录组扩增方法，利用oligo-dT引物和模板置换技术扩增cDNA全长。而10x Genomics则只能获得3'端转录本信息，非全长扩增。 C1 /Smart平台（Fluidigm）是最早应用于单细胞领域的商业化分选技术之一，于2013年推出。该平台通过微流体（FACS）实现96个细胞的自动分离、cDNA合成和基于Smart-seq的扩增。而Chromium（10x Genomics）平台以及其他平台如ddSEQ（Bio-Rad/Illumina）、Nadia（Dolomite）和inDrop（1CellBio）则基于微流控系统（Droplet），将单细胞技术的通量提高到了10000-100000个细胞的量级。 10x Genomics和Drop-seq的测序原理相似，都是通过将细胞封装在微小液滴中进行平行分析来分析数千个单个细胞中的mRNA表达。Drop-seq的具体步骤包括：从组织中制备单细胞悬液将每个细胞与一个带有barcoded微粒（bead）共封装在纳升级液滴中在液滴中分离细胞并裂解捕获细胞的mRNA在伴随微粒上形成STAMP（附着在微粒上的单细胞转录组）在一次反应中反向转录、扩增和测序数千个STAMP 使用STAMP条形码推断每个转录本的来源细胞 Barcode的合成方法是将细胞分为四群，分别标记A、G、C、T四个不同碱基。然后汇合所有细胞重新分为不同的四群，标记AGCT。重复上述步骤12轮，理论上可标记16777216个细胞。

𐟧줺Œ代测序技术全解析𐟔 𐟔쥻𚥺“原理大揭秘𐟔 1️⃣ DNA打断：为了适应Illumina测序的长度限制，通常将DNA打断至150-350bp。这一步通过特定方法进行，确保片段大小均匀。 2️⃣ 补平与加A：打断后的DNA末端可能不平整，需用酶补平，并加上一个特异的碱基A，为后续接adapter做准备。 3️⃣ 连接adapter：利用碱基互补配对原则，将adapter连接到DNA片段上。Adapter不仅提供扩增和测序的引物序列，还包含用于标识不同样本的DNA barcode或index。 4️⃣ PCR扩增：通过PCR技术，将DNA样品浓度增至足够上机测序的水平。 𐟔줸Š机测序流程𐟔 1️⃣ 样品加载：将建库完成的样品加载到flowcell中，每个flowcell包含多个lane，每个lane内有许多tile。 2️⃣ 配对与扩增：样品中的P5序列与flowcell中的特定寡核苷酸接头配对，进行第一轮扩增。随后，新合成的P7'与tile内的5'配对，启动桥式PCR，形成相同序列的簇。 3️⃣ 测序反应：加入标记了荧光基团的A、T、C、G四种碱基，每次只允许一个碱基加入测序链。测序仪发出激发光，扫描荧光以识别碱基。每一轮结束后，通过化学反应改变碱基结构并去除荧光基团，为下一轮测序做准备。通过这一系列精细化的操作和控制，二代测序技术能够高效、准确地解读出DNA序列信息。𐟧좜耀

𐟧줺Œ代测序技术全解析𐟔 𐟔즭婪䤸€：DNA提取与质检纯净、足量、高质量的DNA是测序成功的基石。DNA可以来源于血浆或新鲜组织。 𐟧즭婪䤺Œ：DNA处理与文库构建通过一系列步骤得到特定长度的DNA片段，并加上接头，然后进行PCR扩增。 𐟎玲婪䤸‰：靶向捕获针对特定区域进行基因检测，提高测序效率。 𐟓š步骤四：上机测序根据测序仪的通量选择合适的仪器，上样后由机器自动完成测序过程。 𐟓Š步骤五：数据分析将测序得到的光强数据转化为序列信息，并进行初步、二级和三级分析，最终得到所需的数据解读。 𐟔此外，还有多种建库方法可供选择，如WGS全基因组建库、全外显子组建库等，以满足不同研究需求。 𐟒᤺Œ代测序技术以其高效、准确的特点，在基因组学研究中发挥着重要作用。了解其原理和流程，有助于更好地应用这一技术。

高中生大学生必看！12周生物科研全攻略生物科学是理科学科中的重要领域，对于想要申请留学或保研的学生来说，一段高质量的科研背景至关重要。今天，我将介绍一个令人难以抗拒的生物技术科研项目。 𐟎“适合年级：高中生/大学生 𐟔쩀‚合专业：生物化学、生物医学、分子与生物医学、应用化学、分析化学、仪器分析、光谱学等专业，或希望修读相关专业的学生 𐟓‹项目大纲：仪器分析与生物传感器概论紫外可见吸收光（UV-Vis）分析法荧光探针传感器（Fluorescent probes）：荧光探针及传感器在生物医学领域的应用非标记检测技术（Label Free Detection）：作为基因组测序工具及医学诊断和筛查酶联免疫抗原检测法（ELISA）原理及其在病毒检测、DNA测序方面的应用微流控传感器分析项目回顾与成果展示论文辅导 𐟔쩡𙧛‹绍：这个项目将介绍现代分析化学中的仪器分析，重点包括微流控传感分析、紫外吸收可见光谱、荧光探针传感器等，涵盖化合物及分子的定量精密检测技术。学生将通过项目了解多种现代分析仪器的类型和运作机制，掌握仪器分析的原理、方法和应用领域。项目结束后，学生需提交项目报告并进行成果展示。 𐟎项目收获： 7周在线小组科研学习+5周不限时论文指导学习，共125课时项目报告主导师推荐信 EI/CPCI/Scopus/ProQuest/Crossref/EBSCO或同等级别索引国际会议全文投递与发表指导（可用于申请）结业证书成绩单无论你是高中生还是大学生，这个生物技术科研项目都将为你提供宝贵的科研经验和学术背景，为未来的学术研究和职业发展打下坚实的基础。

Sanger测序：经典与现代的结合 𐟔Sanger测序，又被称为双脱氧链终止法，是一种由Frederick Sanger在1977年发明的经典DNA测序方法。因其高精度和在小规模测序项目中的广泛应用，至今仍被许多实验室所青睐。 𐟔쥟𚦜쥎Ÿ理：构建反应系统：Sanger测序包括四个独立的反应，每个反应都包含所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。ddNTP缺乏延伸所需的3-OH基团，因此当它们被DNA聚合酶掺入到正在合成的DNA链中时，会导致链的延伸在特定的碱基处终止。扩增目的片段：以目的片段为模板，在DNA聚合酶的催化下，从引物处起始开始复制DNA。当遇到ddNTP时，反应停止，产生一系列不同长度的DNA片段，每个片段的终止点由ddNTP决定。凝胶电泳：将这些终止的DNA片段通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离。由于凝胶对不同长度的DNA片段有不同的迁移速度，因此可以通过电泳将它们分开。序列读取：电泳后，通过检测凝胶上的荧光信号或放射自显影，可以读取DNA的碱基序列。每个ddNTP都有不同的荧光标记，因此可以通过荧光信号的不同来确定每个片段的终止碱基。 𐟓š应用领域： 𐟧짼–辑验证：用于验证CRISPR和TALEN等基因编辑技术的准确性。 mRNA制造质量控制：在mRNA疗法和疫苗生产中，用于序列确认。二代测序确认：作为正交方法，用来确认二代测序（NGS）鉴定的变异。微生物鉴定：通过16S rRNA Gene的Sanger测序进行微生物鉴定。 Sanger测序以其高准确性和可靠的结果，仍然是许多实验室和小规模研究的首选技术。尽管新一代测序技术在通量和速度上有所超越，但Sanger测序在特定应用中仍然不可替代。

从零开始：ChIP实验的详细指南（上） 𐟔 ChIP实验的原理和应用在活细胞中，蛋白质和DNA的结合是动态的。为了固定这种结合状态，我们使用甲醛来交联蛋白质和DNA。通过超声或酶切将染色质打断成小片段，然后用抗体特异性识别目标蛋白结合的DNA片段，最后对DNA片段进行纯化和检测（如qPCR、基因芯片、高通量测序等）。 ChIP实验广泛应用于研究转录因子与DNA的结合动态，以及组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 𐟌 细胞固定内源状态下，蛋白质和DNA的结合是动态的，因此需要进行固定以捕获特定状态下的结合情况。最常用的固定试剂是甲醛。甲醛是一种小分子，能够穿透细胞膜和核膜，通过醛基将DNA和蛋白质交联在一起。甲醛交联是可逆的，通过加热可以解除交联，从而方便后续的DNA分析。但是，甲醛交联反应需要一定的时间，作用距离小于2ㅯ𜌥﹨›‹白表位也会有影响。过长时间和过短时间的交联都不利于实验。因此，甲醛交联是ChIP实验的关键步骤。 𐟒ᠧ”𒩆›交联的小贴士细胞生长状态会影响基因表达网络，可能会影响所研究的TF与promoter的结合。因此，细胞长到75%-85%时最好，所需的细胞量为1～2X 107左右。在甲醛交联之前，细胞应尽可能少被人为处理。如果条件允许，直接将甲醛加入培养基中进行交联更好。务必使用有效期以内、正确避光保存的分析或分子生物学级别的甲醛。固定条件通常为室温（不要高于25℃）固定10-15 min。当DNA和靶点结合较弱时，可适当延长交联时间。进行预实验优化交联时间和温度。交联时间过长或温度过高会显著降低染色质超声破碎效率，且可能遮蔽ChIP抗体识别的表位。交联不足可能导致蛋白质和DNA解离。组织交联相比细胞更复杂，大的组织块交联之前切成1-3 mm3大小，建议在真空条件下交联，促进甲醛透过细胞，交联时间可延长至15 min。 𐟌쯸 细胞核抽提及裂解由于蛋白和DNA相互作用主要发生在细胞核内，因此去除胞浆蛋白可以减少背景信号并提高灵敏度。同时，分离的细胞核直接悬浮在剧烈的裂解缓冲液中，更有利于打开细胞核释放染色质。

蛋白质N端测序原理

RIP技术：解析RNA与蛋白的神秘结合 𐟔 实验原理 RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀）是一种研究细胞内RNA与蛋白结合情况的重要方法。其基本原理包括：利用特异性抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中的内源性RNA结合蛋白→通过清洗磁珠来减少非特异性RNA的结合→将RNA结合蛋白及其结合的RNA共沉淀，并进行RNA纯化→最后通过RIP-ChIP、定量PCR和高通量测序来鉴定结合的RNA序列。 𐟓 实验步骤（磁珠法）裂解产物的配制免疫沉淀的磁珠配制 RNA结合蛋白-RNA复合物免疫共沉淀(RIP) RNA的纯化 Input RNA的质量评估（可选）免疫沉淀RNA的分析 𐟓š 具体步骤参考具体实验步骤请参考Milipore RIP试剂盒说明书。

本科生到PI如何高效学习生物信息学？生物信息学是一门涵盖多个领域的交叉学科，包括组学分析、算法研究、数据库构建以及测序原理等。那么，不同层次的学生该如何学习生物信息学呢？本科生如果你是生物信息学专业的学生，建议跟随学校的课程设置进行学习。此外，还需要探索组学分析的基本套路，为未来的研究打下基础。同时，加强数学和计算机科学的学习，也可以为转行做算法研究打下基础。对于生物和临床专业的同学，可以在本科阶段先学习差异分析，为以后的分析工作打下代码和统计学基础。研究生和博士生对于临床学硕、专硕、生物和基础医学的学生，实验室工作可能比较繁重。而生物信息学则不需要长时间待在实验室。可以根据课题需求进行专项学习，比如专注于单细胞研究，重点学习相关的代码和了解核心算法。博后到了博后阶段，你已经成为了实验室的中坚力量。如果没有强烈的需求，只需能看懂结果并了解代码即可。在撰写项目申请书时，可以将这些作为前期基础。 PI 对于已经是PI的老师，建议阅读最新的CNS论文，了解最新的研究方法和思路。如果需要，可以聘请专门的博后进行生物信息学研究。如何学习代码？本科生：全面学习，能学多少学多少。硕博生：以解决问题为目的进行学习。是否需要学习R语言或Python等编程语言，取决于个人兴趣和需求。如果对代码感兴趣或者希望提高工作效率，可以学习这些语言。如果只是进行简单的分析或画图，Excel完全够用。代码学习的程度可以根据自己的需求来定，了解基本语法，能描述清楚问题即可。推荐资源生信技能书：一本很好的生物信息学学习资源。本文不完整，如果有问题请留言，我会在有时间时进行回复。

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