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菌落pcr前沿信息_菌落名词解释微生物(2024年12月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-12-02

菌落pcr

质粒构建全攻略：从零开始到成功转化 𐟎‰ 看着那些又大又圆的转化子，心情是不是特别美妙？质粒构建其实并不难，只要掌握了基本流程和技巧，你也能轻松搞定！下面我就来详细讲解一下质粒构建的整个过程。质粒构建的基本流程 𐟓œ 首先，我们需要准备好插入片段和载体。插入片段可以是gDNA、cDNA或者已有的质粒，只要上面有你需要的片段就行。然后，用PCR扩增出目标片段，回收这个片段。注意，PCR一般用pfu酶，如果扩增不好可以试试g或者保真较好的Taq。设计引物 𐟔犊设计引物时，需要在引物末端加入合适的酶切位点，这样可以让插入片段和载体进行连接。常见的酶切位点有Sacl、HindIII、EcoRI和KpnI等。你也可以采用同源臂的设计，让载体和插入片段通过同源重组进行连接。去磷酸化处理 𐟌Š 在利用单酶切位点或者同尾酶进行克隆连接时，为了防止载体自身环化，需要对载体进行去磷酸化处理。常用的碱性磷酸酶有Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)或者Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)。去磷酸化反应体系一般包括酶切胶回收后的载体DNA、10xSAP buffer、SAP酶和H2O，总体积20ul。大肠杆菌的转化 𐟦 在实验前，将金属浴或者恒温水箱调至42℃。然后从-80℃冰箱取出感受态细胞，于冰上化冻。接着将连接或者无缝克隆产物全部加入100ul感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰上静置15~20分钟。然后42℃热激90秒，迅速置于冰上2分钟。接着在超净台内向热激后的细菌中加入400-800ul不含抗性的LB培养液，置于恒温摇床内37℃200rpm恢复30~45分钟。离心后倒出大部分LB，留少许约100-150ulLB，在超净台吹匀沉淀菌体，将菌体悬液均匀涂布在含有对应抗性的LB平板上（取决于转化的质粒载体抗性，如Amp*或者Kan*）。将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱内培养12-16小时。最后挑取6~10个菌落进行菌落PCR鉴定，或者直接进行液体培养，提取质粒后用酶切的方法鉴定阳性克隆。保存阳性菌 𐟧Š 将鉴定出来的阳性菌进行保存，于标记好的冻存管中，每管中加入30%甘油和300新鲜细菌培养液，充分混匀后置于-80℃保存。注意事项：①如果转化的是纯质粒（非连接或者重组产物），一定要降低使用量和感受态细胞使用量、及涂布细菌量。②-80℃保存菌液时，可以在提质粒时留一点备用。希望这篇攻略能帮到你，祝你早日构建出成功的质粒！𐟚€

超净工作台紫外灯使用全攻略 𐟌Ÿ 菌落PCR与摇菌全流程 1️⃣ 准备工作打开超净工作台，启动紫外灯进行灭菌20~30分钟。将枪头、酒精灯、离心管等放入超净工作台，确保无菌环境。 2️⃣ 配制PCR预混液根据所需菌落数量，计算并配制PCR体系。例如，若要验证16个菌，可先配制20ul体系，再分装至八联管中。 3️⃣ 挑取菌落用10ul枪头轻轻沾取菌落，注意不要沾太多。将沾有菌落的枪头放入PCR预混液中，反复吹打后弃去枪头。 4️⃣ PCR反应将混合好的PCR液体放入PCR仪中进行反应。反应完成后，进行跑胶验证条带大小是否正确。 5️⃣ 摇菌流程将离心管架、50ml离心管、液体培养基LB、枪头等放入超净工作台，再次进行紫外消毒。根据挑菌数量，摆放相应的50ml离心管，并加入5-10ml LB和对应抗生素。打开培养皿，挑选PCR正确的菌落，用白色枪头挑菌，放入离心管中反复吹打后弃去枪头。将离心管放入摇床继续培养，第二天可进行保菌、提质粒或送测。 𐟌Ÿ 超净工作台操作注意事项所有操作均在超净工作台中进行，确保无菌环境。使用紫外灯时，注意安全，避免直视灯光。操作过程中，保持手部稳定，避免污染。

同源重组构建质粒的详细步骤和注意事项 ❤️一、实验步骤 1️⃣ 载体线性化 ❶ 选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。推荐使用双酶切方法，以降低转化背景（假阳性克隆）。 ❷ 酶切时，注意酶切时间，确保载体完全线性化。若使用单酶切，可适当延长酶切时间。 2️⃣ PCR扩增插入片段 ❶ 设计带有同源臂的引物，引物5'端引入与线性化载体末端一致的同源序列（15-20 bp）。 ❷ 使用高保真聚合酶进行PCR扩增，确保扩增片段的准确性与特异性。 3️⃣ 重组反应 ❶ 将线性化载体与扩增的插入片段按一定比例混合，加入重组酶，在一定温度下反应一定时间（如37℃，30分钟）。 ❷ 重组反应完成后，可直接进行转化或储存于-20℃备用。 4️⃣ 转化与筛选 ❶ 将重组产物转化至感受态细胞（如DH5𜉯𜌧𛏨🇧ƒ�€、复苏和涂板等步骤，得到单克隆菌落。 ❷ 通过菌落PCR和质粒提取后的酶切鉴定，筛选阳性克隆。 5️⃣ 测序验证 ❶ 将疑似阳性克隆的菌液送测序公司进行双向测序，比对测序结果与设计序列是否一致。 ❷ 若测序结果正确，则表示重组质粒构建成功，可进行后续实验。 ❤️二、注意事项 1️⃣ 引物设计：同源臂的长度和GC含量需控制在合理范围内（15-20 bp，GC含量40%-60%），以提高重组效率。 2️⃣ 酶切与纯化：确保载体线性化完全，并进行彻底的纯化，避免环状质粒残留。 3️⃣ 重组比例：载体与插入片段的摩尔比通常为1:2，根据实际情况调整。 4️⃣ 转化条件：控制转化产物的量和感受态细胞的状态，以获得理想的转化效率。 ❤️三、原理概述同源重组法基于DNA分子间的同源序列，在重组酶的催化下实现载体与插入片段的定向重组。通过设计带有同源臂的引物，扩增出带有同源序列的插入片段，再与线性化的载体进行重组，最终得到重组质粒。 ❤️四、应用实例以RNase P表达载体的构建为例，通过NCBI查找基因序列，设计带有BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点的引物，扩增目的基因片段。随后，将目的基因片段与线性化的pGEX-2T载体进行同源重组，构建成功后转化至BL21工程菌中表达目的蛋白。

分子克隆实战指南：PCR篇 𐟔奈†子克隆的目的是构建目的基因重组体，并在细胞中验证其成功过表达。以下是主要流程： 1️⃣ PCR：获取目的基因TP53基因的CDS区（1182bp），通过PCR并经琼脂糖凝胶电泳验证条带，然后胶回收目的基因。 2️⃣ 酶切：将目的基因与载体用特定限制性核酸内切酶切割，暴露粘性末端，并分别胶回收这两部分。 3️⃣ 连接：用DNA连接酶连接暴露粘性末端的目的基因和载体。 4️⃣ 转化：将连接成功的环状产物转化到大肠杆菌感受态细胞。 5️⃣ 涂板：12-16小时后挑菌做菌落PCR验证。 6️⃣ 摇菌：直接摇菌中提（见之前菌落PCR笔记，可以省去小提步骤）。 7️⃣ 提取质粒并测序。 8️⃣ 转染：将质粒转染细胞24小时后（记得要有对照组，即只转染试剂组）。 9️⃣ 提取细胞总RNA。 𐟔Ÿ 逆转录成cDNA。 1️⃣1️⃣ 设计qPCR引物（Primer bank查询即可）。 1️⃣2️⃣ 实时荧光定量PCR检测目的基因TP53。 ⚠️注意事项： 1️⃣ PCR试剂盒选择：实验室之前使用Takara的Primer star高保真酶，后期发现很多国货非常好用，如ATG巨匠生物的ATG 2*Proofast Master Mix，PCR结果稳定，酶高保真且扩增效率高。 2️⃣ PCR程序设定的两个关键问题：退火温度：与引物性质有关，注意设计引物软件中的Tm值不应算上酶切位点和保护碱基，应只含互补配对部分，这时的退火温度才是准确的。理论上一定范围内，退火温度高时，特异性好。所以很多同学碰到有杂带的情况，可以适当提高退火温度；反之，如果条带不出，可以适当降低退火温度。延伸时间：延伸时间与片段长度有关，还与酶的延伸效率有关，可以参见DNA聚合酶的说明书。 3️⃣ 通过胶回收获得的产物是未暴露粘性末端的双链DNA，所以还需要后续的限制性核酸内切酶进行酶切，将载体和目的基因片段都暴露粘性末端，才能进一步连接。

菌落PCR秘籍：简单高效菌落PCR 是一种快速鉴定细菌质粒的方法，以下是详细的操作步骤：用高压灭菌的牙签挑取单个菌落，在含有抗性的平板上画线，进行保种。然后将菌落放入含有 20 Triton X-100 的 EP 管中，搅拌均匀。将 EP 管置于 100℃ 煮沸 2 分钟，以裂解细胞并释放质粒。根据预期的质粒大小，准备 PCR 体系，建议使用 20 的体系。模板使用煮过的菌液的上清液，加入 1。上机进行 PCR 反应。退火温度可以稍低于质粒 PCR，经验推荐比质粒 PCR 时稍低。反应完成后，进行电泳检测。阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，进行保种或送测序。详细操作如下：用枪头挑选单菌落到装有 20 水的 PCR 管中，然后悬浮菌液。在做 PCR 时，吸取 1 作为模板。电泳检测后，选择有阳性克隆的菌液 10 与液体培养基中培养。这样做既初步检测了阳性克隆，又保存了所需的菌落。挑菌时，可以用接种环或牙签，看个人喜好。直接用牙签挑单菌落往 PCR 反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。取 200 水，用牙签挑菌，煮沸 5’，冰浴 5’，12000rpm 离心，取上清 5 作为模板。其他的和普通 PCR 一样。用过夜培养的菌液 0.3（不要超过 0.5）做模板，先 94℃ 裂解菌 5 分钟，再加入 Taq 酶。如果发现结果出现非特异带，最好再用液体培养后再做一次 PCR。取菌液 60 至 EP 管中，沸水中煮 5 分钟，离心，取上清 1 作为模板，屡试不爽。用牙签点一下菌落，然后再体系里面涮一下即可。切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑是否能切出。菌落 PCR 不难，但需要注意细节，以确保结果的准确性。

分子克隆全攻略：从原理到操作分子克隆是生物学研究中的一项关键技术，主要用于分离、纯化和扩增特定的DNA片段。以下是分子克隆的主要步骤和原理：质粒提取 𐟌 碱裂解法：利用共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5的条件下，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，而共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。 PCR 𐟔슨š合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：目的是在体外扩增特定的DNA条带。高温变性（Denaturation）：双链DNA在高温下变性，双链打开变成单链。低温退火（Annealing）：引物与模板DNA互补区结合。适温延伸（Extension）：模板DNA-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则和半保留复制原理，引物沿着5'→3'的方向合成新的DNA链。 PCR产物纯化/胶回收 𐟧𜊧滥🃦Ÿ𑦳•：大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA，使得DNA双链变单链，不会被生物大分子溶剂洗脱，但能经水溶性缓冲液水化后，被定量回收，从而实现纯化分离。转化 𐟦 感受态细胞：指细菌在一定的生长阶段，能够吸收外来DNA的状态。转化是指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。原理：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。菌落PCR 𐟏𚊥ŽŸ理：这是一种用单个菌作为模板的鉴定方法，可以快速检测菌落是否为含目的质粒。希望这些信息能帮助你更好地理解分子克隆的原理和操作步骤，祝你在科研道路上顺利前行！

𐟔쥮ž验室必备仪器设备清单𐟓‹ 𐟧꥟𚧡€生物技术实验室必备： 1️⃣ 微型离心机、冰箱、超净工作台、电热鼓风干燥箱 2️⃣ 恒温摇床、恒温水浴、植物培育箱、电子天平 3️⃣ 分子杂交仪、医用型洁净工作台、多功能电子天平 4️⃣ 分光光度计、紫外可见分光光度计 5️⃣ 真空干燥箱、超级恒温水浴、低温浴槽、恒温槽 6️⃣ 光照培养箱、真空浓缩仪、台式冷冻离心机 7️⃣ 高压灭菌锅、电泳仪、基因扩增仪 8️⃣ 精密ph计 𐟔쥾Ÿ物实验室必备： 1️⃣ 超净工作台/生物安全柜 2️⃣ 培养箱：生化培养箱、霉菌培养箱、二氧化碳培养箱 3️⃣ 天平 4️⃣ 微生物均质仪 5️⃣ 菌落计数仪器 6️⃣ 电炉 7️⃣ 高压灭菌锅 8️⃣ 普通显微镜、荧光显微镜等系列 9️⃣ PCR仪器与电泳设备 𐟔Ÿ 纯化设备：滤器，离心管等 1️⃣1️⃣ 摇床 1️⃣2️⃣ 纯水装置 1️⃣3️⃣ 生物显微镜 1️⃣4️⃣ 冷冻干燥机 1️⃣5️⃣ 菌落挑选仪器 1️⃣6️⃣ 分光光度计 1️⃣7️⃣ 恒温干燥箱 1️⃣8️⃣ 恒温水浴锅 1️⃣9️⃣ pH酸度计 2️⃣0️⃣ 离心机 2️⃣1️⃣ 液氮罐 2️⃣2️⃣ 其他耗材：酒精灯等这些仪器设备是实验室研究不可或缺的，确保了实验的准确性和效率。𐟔찟窀

𐟧젥ꌥ䱨𔥯𜟦•™你如何轻松搞定！各位实验达人，求帮助！我最近在做大肠杆菌转化实验，已经尝试了两次，还换了特异引物和通用引物来做菌P，但结果总是差强人意。要么没有条带，要么条带长度不对，导致我的导师开始怀疑是材料问题，让我把未切过的载体和通用引物送去测序。结果晚上十二点半收到邮件，果然是材料问题，感觉自己像个笑话𐟘ž。现在我有三个问题，希望各位能帮我解答！ 1⃣ 重组连接时，我的酶切载体条带不太亮，但扩增出来的启动子却很亮。所以我先稀释了十倍的启动子，然后加了1微升到体系中，酶切载体加了4微升。这个比例合适吗？ 2⃣ 如图3和4所示，我觉得我平板上的单菌落长得还不错（K+抗性，使用DH5„Ÿ受态），摇菌后也都变混浊了，但就是没有条带。师姐说没见过假阳率这么高的卡那抗性板子。所以这个板子看起来正常吗？ 3⃣ 做菌液PCR时，我直接取了1微升菌液，使用了普通2㗔aq Mix酶的程序，只是把预变性时间延长到10分钟（听说这样有利于破壁）。引物是载体的通用引物。导师看了我的板子和没有条带的PCR结果后，说了句“奇怪”，然后让我把质粒和通用引物装袋送测。结果如图1所示，果然不出我所料，感觉自己像个笑话𐟘ž。请问各位有菌P的经验可以分享吗？我用1%的凝胶可以吗？先谢谢各位啦！𐟙

腌制品检验员：食品安全的第一道防线 𐟍– 腌制品检验员的工作是专门针对腌制食品进行全面检测，确保食品的品质和安全性，保护消费者的健康。他们的检测项目包括以下几个方面： 𐟔 外观检验首先，腌制品的外观是一个重要的检测指标。检验员需要检查腌制品的色泽是否统一、鲜亮，以及是否出现发霉、变色或表面粘液等现象。这些情况可能表明腌制过程中出现了问题，可能会影响产品的质量和营养价值。 𐟦 细菌污染检测在腌制肉类的检测中，细菌污染是一个关键项目。如果操作不当或储存条件不佳，可能会导致沙门氏菌、葡萄球菌等有害细菌的污染。这些细菌对人体健康构成威胁，因此需要进行严格的检测。检测方法包括菌落计数和PCR等。 𐟌𑠥𞮧”Ÿ物指标检测除了细菌污染检测外，腌菜等腌制品还需要进行微生物指标检测，如大肠杆菌检测和亚硝酸盐检测，以确保产品的安全性。 𐟛᯸ 农残检验为了确保腌制品的质量安全，检验员还需要检查可能含有的农药残留，包括有机磷、有机氯、杀虫剂等。这些有毒物质必须进行全面检测，以确保产品符合安全标准。 𐟍— 营养成分检验腌制品中含有多种微量元素、维生素和蛋白质等营养成分。检验员需要检测这些营养成分的含量，如蛋白质、糖分、脂肪、维生素C、钙、铁等，以确保产品具有足够的营养价值。 𐟓œ 确保检测方法及文件的有效性检验员还需要确保实验室的检测方法和相关文件处于有效状态。这包括对现有方法的评估和更新，以及对新方法的研究和实施。 𐟔砥†…部监测设备的校验为了确保检测结果的准确性，检验员负责对公司内部的监测设备进行校验，确保设备的准确性和可靠性。 𐟧𙠥맔Ÿ环境的监控检验员需要对工厂的卫生环境进行监控，一旦发现偏差，应及时提出改善方案，预防食品污染，保证产品质量。腌制品检验是一项涉及多个方面的综合性工作，旨在确保腌制食品的安全性。随着市场需求的多样化，腌制品种类不断增加，这对检测技术和标准提出了更高的要求。未来，腌制品检验将继续发展和完善，以适应不断变化的市场需求和技术进步。

𐟐𞠥𞮧”Ÿ物世界：巴氏杆菌属的秘密 𐟔 𐟓Œ 一、鸭疫里氏杆菌：形态与染色：革兰氏阴性，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，瑞氏染色两极着色。培养特性：普通培养基：不生长；麦康凯培养基：不生长；巧克力琼脂：似露珠状的菌落。致病性：主要影响鸭，特别是雏鸭，引起传染性浆膜炎。诊断方法：分离培养、PCR。 𐟓Œ 二、多杀性巴氏杆菌：形态与染色：革兰氏阴性，无鞭毛，不形成芽孢，瑞氏或美蓝染色两极着色。培养特性：普通培养基：生长差；麦康凯培养基：不生长；血琼脂平板：露滴样小菌落，不溶血。致病性：禽类：禽霍乱；猪：猪肺疫；牛羊：牛（羊）出血性败血症；兔：兔巴氏杆菌病。诊断方法：显微镜检查、分离培养、动物试验。 𐟓Œ 三、副猪嗜血杆菌：形态与染色：革兰氏阴性，无鞭毛，无芽孢，新分离的致病菌株有荚膜，美蓝染色呈两极浓染。培养特性：初次培养：需要X因子和V因子；巧克力琼脂：灰白色、半透明的菌落；血琼脂：卫星现象。致病性：主要影响猪，引起多发性浆膜炎、心肌炎、腹膜炎、胸膜炎、脑膜炎以及关节炎。诊断方法：分离培养、PCR。 𐟓Œ 四、猪胸膜肺炎放线杆菌：形态与染色：新鲜病料呈两极染色，有英膜和鞭便毛，具运动性。培养特性：普通培养基：不生长；巧克力琼脂：需要V因子；绵羊血平板：B溶血； cAMP试验：阳性。致病性：主要影响猪，引起猪传染性胸膜肺炎。诊断方法：显微镜检查、分离培养与鉴定、基因检测（PCR）。

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