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蛋白上样缓冲液在线播放_sds-page电泳缓冲液配方(2024年11月免费观看)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：导读更新日期：2024-11-27

蛋白上样缓冲液

WB蛋白上样缓冲液怎么用

𐟧ꥮž验室剧毒试剂替代指南 𐟔젥œ觧‘研实验中，安全永远是第一位的。为了保障实验人员的安全，我们为您列出了实验室中最常用的剧毒试剂及其替代品。 1️⃣ 苯甲基磺酰氟（PMSF）𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：Western/IP/Co-IP 通用裂解液（AIWB-012） ✅ 优点：温和裂解细胞，含多种酶抑制剂，适用于动植物组织和真菌细菌等样品。 2️⃣ DTT二硫苏糖醇𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：即沉SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（AIWB-002、AIWB-0025） ✅ 优点：安全无异味，采用新型还原剂，高效还原二硫键。 3️⃣ 丙烯酰胺和NN-亚甲双丙烯酰胺𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：PNP预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 12孔)（AIWB-001） ✅ 优点：安全方便，即开即用，无需配制，电泳条带清晰，转膜效率高。 4️⃣ 过硫酸铵[（NH4）2S2O8]𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：PAGE胶一步法制备试剂盒（SF06、SF08、SF10、SF12、SF15） ✅ 优点：免染、笔直、一步法、高分辨率。 5️⃣ 十二烷基硫酸钠（SDS）𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：Uni™ SDS PAGE 快速电泳缓冲液（50X）（AFRB-R500、AFRB-R100） ✅ 优点：高均一度、高分辨率、高性价比、简便快捷。 6️⃣ Triton X-100𐟧ꊰŸ”𔠦›🤻㥓：Western/IP/Co-IP 通用裂解液（AIWB-012） ✅ 优点：温和裂解细胞，含多种酶抑制剂，适用于多种样品。 𐟛᯸ 使用这些替代品，既保证了实验的安全，又提高了实验的效率。请务必遵循实验室安全规定，正确使用这些化学试剂。

WB实验必备：6种有毒试剂的防护指南𐟚늱. 𐟧꠨🇧᫩…𘩓𕯼ˆAPS）：强氧化剂特点：具有强烈的氧化性，能漂白染色剂，对皮肤有腐蚀性。防护对策：佩戴适当的手套，避免直接接触，一旦不慎沾染立即用大量水冲洗。 2. 𐟧ꠥ››甲基乙二胺（TEMED）：快速聚合的催化剂特点：挥发性强，散发出难以忍受的气味，腐蚀性强。防护对策：操作时应在通风橱中进行，尽量减少暴露时间，使用后及时清洁工作区域。或者实验室时刻保存通风，开窗。 3. 𐟧ꠢeta巯基乙醇/二硫苏糖醇（2-ME/DTT）：蛋白上样缓冲液中的还原剂特点：挥发性高，具有刺激性气味，吸入或皮肤吸收可能导致不适。防护对策：使用时尽量在通风环境下操作，使用完毕后彻底洗手和清洁工作台。 4. 𐟧꠨‹倫𒥟𚧣𚩅𐦰Ÿ（PMSF）：蛋白酶抑制剂特点：对皮肤和呼吸道有腐蚀性和刺激性，毒性较强。防护对策：穿戴实验服和手套，小心操作，确保不在无通风的环境下使用。 5. 𐟧ꠥ二烷基硫酸钠（SDS）特点：SDS对皮肤和眼睛有轻微刺激性。防护对策：处理SDS时戴上手套，避免接触眼睛；而甲醇则应在良好的通风条件下使用，并严禁食用。 6. 𐟧ꠧ”𒩆‡：细胞膜的破坏者特点：蛋白质固定剂，假酒的主要成分，甲醇是强烈的神经毒素。防护对策：避免甲醇接触皮肤和眼睛，以免对身体造成伤害。温馨提示：做好个人防护装备：防护服-白大褂能够为你挡住飞溅的化学物；口罩防止吸入有害蒸汽；橡胶或丁腈手套守护你的双手。

SDS-PAGE电泳：操作指南 𐟔찟”찟”젒IPA裂解缓冲液：25 mM Tris-HCl pH 7.6；150 mM NaCl；5 mM EDTA；1% Triton X-100；1% 十二烷基硫酸钠（SDS）；0.1% 脱氧胆酸钠；1 mM PMSF 𐟧𙠦“作注意事项： 1️⃣ 玻璃板清洗：先用自来水彻底清洗两面，再用蒸馏水冲洗干净，确保玻璃板中没有杂质。清洗后立在筐里晾干或烘箱中烘干。 2️⃣ 配胶操作：必须在通风橱中进行。 3️⃣ 封胶与吸水：加入水或无水乙醇后建议关闭通风，吸水或无水乙醇后，建议通风吹10分钟左右。 4️⃣ 灌胶技巧：避免胶板内出现气泡。 5️⃣ 上样过程：避免样品溢出或进入其他泳道。 6️⃣ 空泳道处理：可以加入5上样缓冲液，防止相邻泳道扩散至空泳道。 7️⃣ 毒性提示：丙烯酰胺（Acrylamide）有毒性，TEMED有腐蚀性和挥发性，APS对皮肤黏膜有刺激性和腐蚀性，SDS对黏膜、上呼吸道、眼和皮肤有刺激作用，蛋白loading buffer也有毒性。 8️⃣ 加入顺序：30%Acr和TEMED建议放在倒数第二和第一的位置加入。 𐟓 操作步骤：清洗玻璃板在通风橱中配胶灌胶并避免气泡上样并防止样品溢出处理空泳道 𐟚렦𓨦„事项：丙烯酰胺（Acrylamide）有毒性 TEMED有腐蚀性和挥发性 APS对皮肤黏膜有刺激性和腐蚀性 SDS对黏膜、上呼吸道、眼和皮肤有刺激作用蛋白loading buffer有毒性 𐟓‹ 操作技巧：清洗玻璃板时要彻底，确保没有杂质。配胶时要在通风橱中进行，注意安全。灌胶时要小心，避免气泡产生。上样时要避免样品溢出，确保样品均匀分布。处理空泳道时可以加入上样缓冲液，防止扩散。 𐟔찟”찟”젥ꌦ“作时，请务必注意安全，遵守实验室规定，确保实验顺利进行。

史上最全WB实验操作及原理讲解③ Western Blot 实验通常使用SDS-PAGE进行电泳，根据目的蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。以10%的SDS-PAGE自制胶为例，以下是详细的操作步骤和注意事项：制备凝胶 𐟧ꊨㅩ…好灌胶的模具，按照配方配置分离胶（适量的丙烯酰胺溶液、10% SDS、分离胶缓冲液），加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（不要产生气泡）后缓慢加入到模具中。再在页面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40分钟。待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。同样按比例配置浓缩胶（浓缩胶浓度较分离胶低），缓慢加入分离胶的上面，直至灌满。将梳子插入凝胶内，注意不得在梳子齿尖留有气泡，静置60分钟以上待凝胶聚合后拔出梳子。注意事项及原理 𐟓‹ 分离胶浓度：不同的分离胶浓度对不同的目的蛋白分子量的分辨率不一样，所以Western Blot中分离胶浓度的选择取决于目的蛋白分子量。过硫酸铵和TEMED的量：聚丙烯酰胺(PAGE)是由丙烯酰胺聚合形成的高分子，这个聚合反应是自由基聚合，需要有引发剂产生自由基将反应引发。过硫酸铵（AP）就是引发剂，而TEMED（四甲基乙二胺）可以催化过硫酸铵产生自由基，催化聚丙烯酰胺单体聚合成网状结构。但是两者的量一定适宜，否则会有烧胶或带变形的可能。加入一层水：在注入分离胶后上面需要加入一层水，这是因为空气中的氧分子会氧化AP使其活性减弱。加入这层水后可以让反应快速进行，同时也保证了分离胶上层面的平整。加样 𐟒犥𐏥🃦‹”出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。将电泳缓冲液加入内外槽，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲液中。将待测蛋白样品与上样缓冲液按比例混合，沸水中加热3-5分钟使蛋白充分变性。将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。加样时间要尽量短，以免样品扩散。电泳 𐟔‹ 当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。电泳时通常上层浓缩胶时采用低电压（80-100V）恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层分离胶时采用高电压（120V）恒压电泳。溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端时停止电泳。电泳完毕的胶完整地放在盛有电泳液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来。持续更新，敬请关注~

WB实验中蛋白煮沸的四大原因在进行WB（Western Blot）实验时，每次上样前都需要将蛋白样品进行煮沸处理。这个步骤看似简单，但实际上却对实验结果有着至关重要的影响。那么，为什么每次上样都需要煮蛋白呢？让我们一起来探讨一下其中的原理吧！促进 SDS 与蛋白质的结合 𐟒ꊓDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质结合，使其完全变性和解聚，形成带负电荷的棒状结构。这种结构在电场中能够稳定迁移，是电泳分离的基础。然而，SDS 与蛋白质的结合并非自发进行，需要一定的条件来加速这个过程。高温处理（如煮沸）能够显著提高 SDS 与蛋白质的结合效率，确保蛋白质完全变性和解聚，便于后续蛋白质分子量大小的分离。破坏蛋白质的高级结构 𐟏—️ 蛋白质的高级结构（包括二级、三级和四级结构）是由多种非共价键（如氢键、疏水键、离子键等）维持的。这些高级结构在电泳过程中可能会干扰蛋白质的迁移，导致实验结果不准确。煮沸处理能够破坏这些非共价键，使蛋白质的高级结构解体，转变为线性结构。这样，蛋白质在电泳时的迁移率与分子量大小有关。灭活蛋白酶 𐟔动›‹白酶是一类能够水解蛋白质的酶类，它们的存在严重干扰 WB 实验结果。在样品制备和处理过程中，如果未能有效灭活蛋白酶，它们可能会降解蛋白质，导致实验结果出现偏差。煮沸处理是一种有效的灭活蛋白酶的方法，能够确保蛋白质在电泳过程中保持完整，不被降解。提高蛋白样品的稳定性 ⚖️ 煮沸处理不仅能够促进 SDS 与蛋白质的结合、破坏蛋白质的高级结构、灭活蛋白酶，还能够提高蛋白样品的稳定性。确保实验结果的可能性和重复性，每次上样前对蛋白样品进行煮沸处理，能够确保实验条件一致性，从而提高实验结果的可靠性和重复性。如果省略这一步骤，不同批次或不同实验者之间的实验结果可能出现较大差异。煮蛋白的具体操作步骤 𐟍𓊧…‹白的过程通常是将蛋白样品与上样缓冲液混合后，在沸水浴或PCR仪中加热至95-100Ⰳ，煮3-5分钟。加热过程中需要不断摇动或搅拌样品，以确保受热均匀。除个别蛋白样品外，如膜蛋白不宜高温，一般37℃放置10分钟，而核蛋白先配平后，不需要进行煮沸，直接离心上样。煮蛋白时间不宜过长，不然可能会导致蛋白变性，影响后续实验结果；煮蛋白温度控制在95-100Ⰳ之间为宜，常规煮蛋白时间为3-5分钟，如果样品浓度过浓时就煮10分钟。煮蛋白10分钟后，仍然吸不出来，适当增加 Buffer，继续煮，也可以对样品进行超声。若煮样的时间过长，蛋白出现凝固，建议丢了吧，没用了；煮蛋白过程中要记得混匀样本，确保样本受热均匀。通过以上几点，我们可以看出，煮蛋白在WB实验中扮演着至关重要的角色，确保了实验的准确性和可靠性。希望这篇文章能帮助你更好地理解WB实验中煮蛋白的必要性！

𐟧엥stern blot实验全攻略𐟔 𐟓实验步骤来啦！ 1️⃣ **制样与上样** - 准备蛋白样品，加入上样缓冲液。 - 沸水煮5分钟，使蛋白变性。 - 组装电泳槽，倒入电泳液。 - 加样，注意电压和电流的设置哦！ 2️⃣ **跑胶** - 选择合适的电压和电流，让蛋白样品在胶中分离。 - 跑完胶后，将胶保存至-20℃，以备复用。 3️⃣ **转膜** - 制作三明治模型，将胶和PVDF膜夹在中间。 - 插电，选择合适的电压和时间，让蛋白从胶转移到膜上。 4️⃣ **封闭与抗体孵育** - 用封闭液封闭PVDF膜，减少非特异性结合。 - 加入一抗，让抗体与目的蛋白结合。 - 洗膜后，加入二抗，让抗体与一抗结合。 5️⃣ **曝光与结果分析** - 制作曝光液，将膜进行曝光。 - 观察结果，分析目的蛋白的表达情况。 𐟎‰完成实验啦！你学会Western blot了吗？快去试试吧！

𐟧쨁š丙烯酰胺凝胶电泳检测技巧 𐟔 蛋白质纯度鉴定，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来帮忙！这是最简单、成本低的检测方法，灵敏度高，能轻松确定样品中蛋白质组分数目。 𐟒ᠥŸ𚦜쥎Ÿ理：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质，利用电泳分离蛋白质。凝胶机械强度好，稳定透明，是理想的电泳支持物。 𐟓 实验步骤来啦： 1️⃣ 制胶：根据蛋白大小，选择合适浓度的胶，蛋白小选高浓度，蛋白大选低浓度。 2️⃣ 加样、电泳：胶凝固后，加入蛋白marker和待测蛋白，倒入电泳缓冲液，接通电源开始跑胶。 3️⃣ 染色、脱色：等溴酚蓝跑到胶末端，关闭电源，去除浓缩胶，分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟，再放入脱色液中脱色1小时。 4️⃣ 结果解读：根据Marker判断蛋白大小，看有无杂带判断纯度，用BSA标准品制作标曲，计算目的蛋白浓度。 𐟓‹ 样品要求：浓度>0.5ug/ul，体积>50ul，含盐量≤20mM。 𐟔젩€‰择实验方法时，考虑是否需要还原剂。还原性-SDS-PAGE检测含还原剂上样缓冲液，非还原性-SDS-PAGE则不含。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚨š丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质纯度鉴定的好帮手，掌握技巧，轻松上手！

Western Blot实验全流程详解 Western Blot是一种常用的蛋白质检测方法，以下是详细的实验步骤：取材 𐟧슩斥…ˆ，根据实验需求取材。提取蛋白质 𐟒ꊥ𐆥–出的材料进行蛋白质提取。 BCA法测蛋白质浓度 𐟓 使用BCA法测定蛋白质浓度。制备蛋白质上样样本 𐟓‹ 将提取的蛋白质制备成上样样本。制备PAGE胶 𐟧ꊦŒ‰照说明书依次加入超纯水、30%丙烯酰胺、分离胶缓冲液、10%过硫酸铵和TEMED，然后加入分离胶，用无水乙醇液封。室温静置30分钟，待分离胶完全凝固后倒掉无水乙醇。接着配制浓缩胶，加入浓缩胶缓冲液、30%丙烯酰胺、10%过硫酸铵和TEMED，插入制胶梳，室温静置30分钟。PAGE胶一般现配现用，如果不用，可装入封口袋中加入少许超纯水保持湿润，放在4℃冰箱中保存。 SDS-PAGE电泳 ⚡ 将PAGE胶用电泳夹固定好，倒入新鲜配制的电泳缓冲液，依次将蛋白上样样本加入到上样孔中，在样本两边加入蛋白marker，最后进行电泳，电泳条件是200V，30分钟，当澳酚蓝指示带到达胶底部时电泳完成。转膜 𐟌 电泳完毕后，用双蒸水洗涤PAGE胶，去除残留的电泳缓冲液。将剪好的PVDF膜放入甲醇中激活，将膜、海绵、滤纸一起放入转膜液中，用翘板撬开玻璃板，切除胶多余的部分，按照顺序将海绵、滤纸、胶、膜放在电泳夹里面，合起电泳夹。将夹子放入转印电极中，倒入转膜缓冲液，进行转膜，转膜条件是200mA，120分钟。注意：电泳仪放在冰盒里，因为电流过大会发热，胶可能会变形。封闭 𐟔’ 将膜放入TBST中洗涤3次，每次5分钟。洗涤完毕后，加入5%脱脂牛奶进行封闭，将抗体孵育盒放到摇床上，室温封闭1小时。一抗孵育 𐟐›ž收封闭液，将提前配制好的一抗溶液加入到抗体孵育盒中，将抗体孵育盒放到摇床上，4℃孵育过夜。二抗孵育 𐟐‘ 将一抗回收后，用TBST洗涤3次，每次5分钟。洗涤完毕后将二抗溶液加入到抗体孵育盒中，将抗体孵育盒放到摇床上，室温孵育1小时。孵育完毕后，回收二抗溶液，用TBST洗涤3次，每次5分钟。化学发光 𐟌Ÿ 进行化学发光检测。通过以上步骤，你可以完成Western Blot实验，检测蛋白质的表达情况。

影响核酸凝胶电泳结果的五大因素探索核酸凝胶电泳的奥秘，我们发现有许多因素影响着实验的结果。让我们一起来看看这些关键因素吧！𐟔 1️⃣ DNA样品的纯度和状态 𐟒犄NA样品的纯度是电泳结果清晰的关键。如果样品中含有过多的盐或杂质蛋白，可能会导致条带模糊甚至缺失。乙醇沉淀可以去除多余的盐，而酚则可以去除蛋白。记住，变性的DNA样品可能会导致条带模糊和缺失，因此在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 2️⃣ DNA的上样 𐟓 正确的DNA上样量是保证条带清晰的关键。上样量过大可能导致DNA带型模糊，影响判断其大小；而上样量太小则会导致带信号弱甚至缺失。 3️⃣ Marker的选择 𐟎œ脎A电泳中，使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小是非常重要的。选择在目标片段大小附近ladder较密的Marker，可以更准确地估计目标片段大小。如果选择NA/HindIII或者NA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5分钟，冰上冷却后使用，以避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 4️⃣ 凝胶的染色和观察 𐟌ˆ 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭(EB)，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。观察凝胶时，应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。 5️⃣ 凝胶图的分析 𐟓Š 通过分析凝胶图，我们可以检测到DNA的降解或其他杂质的存在。例如，线性的单一DNA样品一般是单条带，质粒的话可能会有2-3条带，这和DNA分子的构象有关。如果条带变宽、变暗、或者变成弥散的DNA条带，表示DNA非特异的降解，还有一种可能是太久没有更换电泳缓冲液造成的。如果有蛋白质污染，上样孔可能发亮。如果跑胶时DNA上样量过多导致条带宽度大，无法准确判断其大小。通过这些关键因素的分析，我们可以更好地理解和控制核酸凝胶电泳的结果，从而获得更准确和可靠的数据。𐟓ˆ

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