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wb一抗孵育时间新上映_wb一抗孵育时间是多久(2024年12月抢先看)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：导读更新日期：2024-12-01

wb一抗孵育时间

WB实验常见问题及解决方法详解大家好，今天我们来聊聊WB实验中一抗孵育的注意事项和一些常见问题。希望这些小贴士能帮助大家在实验中少走弯路，早日取得满意的结果！内参选择的小窍门 𐟧 在WB实验中，内参的选择非常重要。内参通常用于对照目的蛋白的相对丰度。选择内参时要考虑目的蛋白的分子量（一般建议目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上，但不要差距太大），表达部位以及实验的具体情况。具体注意事项可以参考图一。抗体回收？不推荐！ 𐟚늊关于抗体的回收和重复使用，我们并不推荐。使用过的抗体可能会因为浓度变化和污染问题而影响实验结果。所以，还是一次性使用为好。常见问题解析 𐟔 没有条带可能原因：抗体变质或种属选择错误。确认抗体是否超过保质期或保存得当。确认说明书上是否有推荐所用的物种。背景脏或非特异性条带可能原因：一抗特异性不好或浓度过高。由于大多数抗体的开发基于多肽免疫，容易出现非特异性结合。增加漂洗次数与时间。优化曝光时间。优先选择特异性好的抗体，如兔单抗。适当提高一抗稀释比并4Ⰳ过夜孵育。抗体稀释液中增加脱脂奶粉。条带信号弱可能原因：一抗浓度低。适当提高一抗浓度。增加一抗孵育时间。更换效价更高的一抗。降低洗涤液中的去污剂浓度和漂洗时间/次数。条带反白可能原因：一抗浓度过高。有的小伙伴发现条带信号较弱后就开始提高一抗浓度并增加上样量，结果中心部位高浓度HRP底物很快被消耗殆尽，然后就不发光了，于是出现反白条带。调整建议：降低一抗浓度。小结 𐟓 今天的“战神”专辑就暂时到这了，希望这些小贴士能帮助大家在WB实验中少走弯路，早日取得满意的结果！下次再见！

MAPK通路蛋白：MEK1/2&ERK 𐟔 前情提示： 1️⃣ 所有实验结果均来自小鼠肝脏组织的蛋白样本（由于模型复杂且干预因素众多，具体细节不赘述）。 2️⃣ 电泳液、转膜液、TBST均采用粉末配置成10X，再稀释至1X（经济节约）。电泳时间未详细记录，转膜条件为300mA，70分钟。 3️⃣ 一抗孵育时间为14-16小时，洗膜步骤为1✖️TBST，5分钟*3；二抗孵育时间为1小时，洗膜步骤为1✖️TBST，10分钟*3。 𐟓Š 图一：MAPK通路，MEK1/2，稀释比1:1000，结果显示条带清晰，无杂带，目的条带表达强烈。 𐟓Š 图二：MAPK通路，ERK，稀释比1:1000，条带位置清晰，基本无杂带。 𐟓Š 图三：MAPK通路，p38，条带较为杂乱，可能原因包括一抗特异性不足或稀释比需要调整。pp38条带位置与预期有所不同，需要进一步优化实验条件。 𐟤 作为WB新手，欢迎各位高手交流实验经验！

𐟧엂实验全攻略𐟒ꊰŸ” 准备开始你的WB实验了吗？这里有一份超详细的攻略等你来拿！ 1️⃣ 收集蛋白样本𐟧ꊠ - 估算皿内细胞数量，合理添加裂解液。 - 用PBS清洗后，加入胰酶消化，再离心收集。 - 加入buffer进行裂解，注意10cm皿可加150裂解液。 2️⃣ 上样准备𐟓 - 标记好上样顺序和对应的一抗、二抗。 - 二抗可多次使用，但记得提前取出化冻。 3️⃣ 封闭与孵育𐟔’ - 封闭时间约1小时，为后续孵育做准备。 - 一抗孵育后，用牛奶配制的二抗进行孵育，时间约1小时。 4️⃣ 曝光与图片整理𐟓𘊠 - 曝光时注意顺序，剪掉强条带下的弱条带。 - 曝光后及时整理图片，并保存原图与处理图。 - 反思实验结果，调整上样量或抗体使用策略。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚊 - 做好实验记录，包括日期、操作步骤和结果。 - 合理保存抗体和样品，避免反复冻融。 - 选择合适的曝光时间和显影液浓度。现在就开始你的WB实验之旅吧！𐟚€

𐟧WB出现非特异性条带怎么办？ 𐟤”跑WB时遇到超多非特异性条带？别担心，这里有一些实用的解决方法！ 𐟒ᩦ–先，优化封闭条件是个不错的选择。尝试使用3%脱脂奶在室温下封闭1小时，这有助于减少背景噪音。 𐟒‰另外，一抗孵育也很关键。建议将一抗以1:1500的比例稀释，并使用3%脱脂奶和TBST配置稀释液，在4度过夜孵育。 𐟒ᨿ˜有一些小技巧可以分享：通过精细调整实验条件，如温度、时间、浓度等，可以进一步减少非特异性条带的产生。 𐟔希望这些建议能帮到你，让你的WB实验更加准确、高效！

普通人做WB实验时遇到的那些意想不到的坑 1. 孵育一抗时，环境温度看似适宜，但第二天却发现牛奶变质发臭了𐟘“。上样量不足，导致没有显影，结果全是白板或黑板𐟘“。上样量过多，显影效果太粗，条带不清晰𐟘“。上样不均匀，出现空条带，影响实验结果𐟘“。裁剪时误将条带剪掉，损失宝贵样本𐟘“。条带上有气泡，影响实验效果𐟘“。动物样本和人样本一起跑电泳，结果显影不均匀，影响实验结论𐟘“。这半年做了十多次WB实验，每次都有意想不到的坑等着我𐟘“。不过好在毕业前终于跑出了能交差的条带，真是松了一口气𐟘…。

ABmart抗体：科研实验的得力助手𐟑 ABmart的抗体真的是国货中的佼佼者，用过一次你就会爱上它。它的条带特别清晰，曝光效果极佳。我使用的是ABmart提供的抗体试用装，几乎所有的WB实验都用的是ABmart的抗体。以下是我跑WB实验的结果，LC3和内参GAPDH的条带都非常清晰。 LC3抗体货号T55992，GAPDH抗体货号M20006。跑LC3蛋白的实验条件是：12%的胶，先60V跑30分钟，然后120V跑80分钟。转膜使用的是伯乐半干转，15分钟。封闭用的是5%脱脂牛奶，封闭时间为1小时。一抗在4度下孵育过夜，二抗用1:10000的比例，室温孵育1小时。 ABmart的抗体真的是科研实验的好帮手，强烈推荐给大家！

WB实验全攻略：从准备到结果，一篇就够！嘿，大家好！今天我们来聊聊WB实验的那些事儿，这可是生物化学实验中的大咖哦！𐟌Ÿ 𐟔 实验原理：就像侦探追捕线索一样，WB实验通过特定的抗体技术，精准找到蛋白质的藏身之处。 𐟔 准备事项：蛋白样品的质量是关键！提取蛋白时记得加蛋白酶抑制剂PMSF，防止蛋白降解。抗体选择也很重要，要根据实验需求挑选适合的抗体，并优化抗体的稀释比和孵育时间。 𐟔 步骤解析：选对膜和转膜时间很重要！将一抗与膜上的蛋白质结合，再与二抗结合。最后，根据实验需求选择合适的显色方法。 𐟔 注意事项：细节决定成败！样本蛋白表达量低可能会影响结果，可以尝试增加上样量或选择表达量较高的细胞系作为阳性对照。转膜时注意高分子量蛋白可能需要更长的转膜时间。 𐟔 优化建议：为了获得更好的实验结果，可以进行一些优化。选择合适的裂解液和分离胶浓度，充分混匀并避免气泡产生。转膜后进行封闭操作，以避免抗体与非特异性位点结合。 ✨ 好啦，以上就是关于WB实验的小知识啦！觉得有用就点赞支持一下吧～𐟑 如果你有任何问题或想法，欢迎在评论区留言交流！𐟒젨ˆ‘们一起在生物化学的世界里探索更多的奥秘吧！𐟚€

WB实验初体验：努力终有回报！实验小白们，加油！终于搞定了第一个能看的WB结果，真不容易啊！分享一下我的经验，希望大家也能受益。上样：细胞20ug 这个步骤很关键，细胞量要控制好，太多太少都不行。变性：100℃ 10分钟，然后4℃保存变性时间要足够，温度也不能太高，不然蛋白会变性。分离胶和浓缩胶的制备目标分子量97KDa，浓缩胶浓度8%。分离胶和浓缩胶的制备很重要，浓度不对会影响电泳效果。电泳 1L电泳液配置（tris:3.03g+甘氨酸：14.4g+甲醇250ML）。分离胶电压80V，跑过分离胶后提高电压。浓缩胶电压120V。电泳时间根据蛋白分子量大小调整，我的目标是97-115KDa，时间大概1小时30分钟。转膜黑色海绵-4层滤纸-胶-PVDF膜-4层滤纸-黄色海绵，夹板夹紧，不允许有气泡。转膜电流270-350V，根据滤纸薄厚调整电流大小，我的电流是280V。转膜时间根据蛋白分子量大小调整，我的时间是1小时30分钟。牛奶封闭 2.5g牛奶+50mlPBST，60转封闭1小时。封闭时间要足够，不然抗体结合不好。过夜孵育一抗这个步骤很重要，一抗要孵育过夜，效果才好。第二天收集一抗待回收再次用，用PBST 75转漂洗3次，每次10分钟。再次孵育二抗，75转1小时。收集二抗待用，再次用PBST 75转漂洗3次，每次10分钟。发光显影发光液1:1配置，这个步骤很简单，但也很关键。希望大家都能顺利完成WB实验，加油！𐟒ꀀ

𐟔„电转液配置与转膜技巧 𐟧ꩅ置电转液是跑出平整WB的关键一步！使用索莱宝的10㗧”𕨽즶𒱰0ml，加入甲醇200ml和up水700ml，混合成1L的1㗧”𕨽즶𒯼Œ4℃冷藏保存。 𐟔騽쨆œ时，根据目的蛋白分子量切胶，并裁剪适当大小的PVDF膜。使用甲醇激活膜后，进行半干转或湿转操作。 𐟒᥍Š干转时，按照滤纸片-膜-胶-滤纸片的顺序叠放，恒压12v转1小时。湿转则采用“三明治”系统，恒流200ma转90分钟。 𐟓Œ注意：电转系统需置于冰盒中以防止产热，且湿转的电泳液一般使用一两次后更换。 𐟔’封闭步骤也很关键，可选择脱脂奶粉或快速封闭液进行封闭，时间充裕时推荐使用脱脂奶粉封闭2小时。 𐟒‰最后，选择好的一抗进行孵育，一般1：1000的比例使用。将全膜放在抗体孵育盒中，4℃摇床缓慢孵育12～18小时。 𐟎‰掌握这些技巧，你的WB实验定能更加成功！

WB实验全攻略：从零开始到成功曝光在WB实验领域摸爬滚打了四年，我积累了不少心得。从细胞培养的第一步到最后的化学发光成像，每一个细节都至关重要。两天的辛勤工作，往往在曝光的瞬间决定成败。下面是我总结的一些关键步骤，希望能帮到你们。电转：关键的一步 𐟔犦🀦𔻐VDF膜：PVDF膜需要在甲醇和4度中激活30分钟。电泳后处理：电泳结束后，取出胶板，短玻璃板朝上放置。揭开短玻璃板后切除多余的胶，在水中将胶从长玻璃板上取下。转膜：在电转液中，转膜夹黑色面朝下，依次放置石棉网-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-石棉网，夹紧转膜夹，注意PVDF膜要与胶贴合，排走气泡。调整转膜夹黑色界面转向转膜槽负极，白色面朝向转膜槽正极。灌满电转液后，用200mA恒定电流转膜120分钟（具体条件自行探索），转膜槽外周装满冰块。封闭：去除背景的关键 𐟐„ 转移膜：将膜取出后，应观察到marker完全从胶转移至膜上。清洗：用TBST快速清洗掉膜上残留的电转液。封闭：将PVDF膜浸泡在5%封闭牛奶中，缓慢摇荡，室温孵育1小时。抗体孵育和化学发光成像：让蛋白可视化 𐟌Ÿ 一抗孵育：封闭结束后，用1㗔BST缓冲液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5分钟，共3次。一抗使用一抗稀释液或TBST按照1：5000稀释（具体条件自行摸索），然后将膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中摇床孵育过夜。二抗孵育：一抗孵育后并回收，加入1㗔BST缓冲液放置于摇床上快摇5分钟，共3次。使用5%脱脂牛奶按照1:1000稀释二抗，室温慢摇1小时。化学发光成像：二抗孵育完毕后，回收二抗，1㗔BST快洗5分钟，共3次。洗膜结束后，将发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集并使用ImageJ分析灰度。希望这些步骤能帮到你们，祝大家实验顺利！𐟒ꀀ

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