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上游引物最新视觉报道_上游引物和下游引物的区别(2024年12月全程跟踪)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：热点更新日期：2024-12-02

上游引物

拟南芥突变体鉴定三引物法 𐟌𑤻妋Ÿ南芥（Arabidopsis thaliana）的ACD5基因为例，我们来学习如何使用Primer3 Plus设计引物吧！ 1️⃣ 首先，登录Ensembl plant数据库，选择拟南芥作为物种，并输入ACD5基因，点击“go”。 2️⃣ 在搜索结果中，点击选中的基因，再选择一个转录本和cDNA。 3️⃣ 点击“Configure this page”，然后显示外显子。 4️⃣ 下载cDNA序列，选择RTF格式，并包含行号。 5️⃣ 下载后，你会看到蓝色部分代表外显子。 6️⃣ 接下来，打开Primer3 Plus，将下载的序列粘贴进去，选择qPCR策略。 7️⃣ 在3’端选择两个外显子的连接处，将后面一个的第一位作为primer overlap position。 8️⃣ 进入“General Settings”，按照引物设计原则设置数值： - S代表上游引物，A代表下游引物。 - tm在58左右，正负2度（55-65），上下游引物Tm差最好不要超过5℃。 - GC%在40%-60%。 - 3’末端不能是A，最好是T。 - 不能有连续3个相同的碱基。 - 3’端一定不能有错配。 - 引物自身和引物之间不能有4个连续的碱基互补。 - 退火温度要适宜，温度高则扩增特异性强，温度低则扩增效率高。 - 引物长度一般在15-30个碱基。 9️⃣ 点击“Pick Primer”，即可获得引物。之后点击“previous”和“Next”查看上下引物，并检查是否有潜在的高级结构如发夹结构和二聚体。 𐟔Ÿ 最后，使用primer blast输入上下游引物，选择正确的库和物种，点击“Get Primer”，查看引物的长度、Tm值、GC含量等分析结果。确保引物不会匹配到同物种或不同物种的其他基因。

科研新手必看！RPA稀释攻略终于踏入了科研的大门，决定从RPA恒温扩增实验开始。记录一下这段摸索的过程，希望能帮到同样迷茫的你们。引物探针的稀释方法 𐟧ꊊ首先，我们需要了解如何稀释引物和探针。这个过程其实并不复杂，但需要一些小技巧。上游引物稀释倍数：335ul 摩尔消光系数：3.3nmol/OD 操作步骤：取33.5ul的上游引物，加入到100uM的浓度中，最终得到10uM的浓度。下游引物稀释倍数：300ul 摩尔消光系数：3.4nmol/OD 操作步骤：取30ul的下游引物，加入到100uM的浓度中，最终得到10uM的浓度。探针稀释倍数：200ul 摩尔消光系数：2nmol/OD 操作步骤：取20ul的探针，加入到100uM的浓度中，最终得到10uM的浓度。测试实际浓度 𐟓Š 如果你想要测试实际的浓度，可以使用分光光度计。具体操作如下：使用分光光度计测试上述溶液的A260值。乘以摩尔消光系数，即可得到实际浓度。小贴士 𐟒ኦ ‡记管子：为了方便后续实验，建议在每个管子上标记好引物和探针的名称、浓度等信息。无菌操作：整个过程需要在无菌条件下进行，避免污染。希望这些信息能帮到你，祝大家实验顺利！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！

拟南芥筛选你已经成功筛选出了T1代拟南芥，通过潮霉素筛选，DNA粗提后PCR检测显示96个样本基本全阳。你使用的是基因上游引物和载体通用下游引物。接下来，你可能会面临几个选择： 1️⃣ 基因表达水平验证：是否需要对每一代都进行qPCR或Western blot来验证基因表达或蛋白表达水平？还是说，等到拿到纯合的T3株系后再筛选高表达株系？ 2️⃣ 纯合株系筛选：你提到T1代收种子后铺板，选择阳性率3:1的株系继续种植。这是否意味着除了DNA粗筛，还需要额外数性状数量这一步？3:1的阳性苗种下去收T2代种子，铺板鉴定全阳，这个T2株系就是纯合株系，可以用来生长T3，进行表型实验。 3️⃣ 筛选策略：你提到只挑15-30个株系往下做应该够了吧？这是否意味着在每一代都进行基因表达或蛋白表达水平的验证？ 4️⃣ T2代纯合鉴定：T2代种子收获后，是否需要进行进一步的纯合鉴定？如何确保T2代种子是纯合的？ 5️⃣ 表型实验：一旦你有了纯合的T3株系，你将如何进行表型实验？这是否意味着你可以开始进行更深入的功能研究？以上是你可能需要考虑的几个关键点。希望这些信息能帮助你顺利进行拟南芥的纯合鉴定和功能研究。𐟌𑰟”쀀

𐟧쳲-无缝克隆操作指南 𐟔젤𘺤𚆦升克隆效率并减少突变，推荐使用高保真PCR Mix来扩增DNA。同时，预线性化的质粒作为模板是更好的选择哦！ 𐟓 引物设计小技巧： - PCR引物的5'端，要包含与相邻片段同源的15-25nt序列，推荐18nt，确保扩增产物能与相邻片段形成重叠。 𐟓 插入片段的引物设计如下： - 正向扩增引物：5'端是上游载体末端的正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列。 - 反向扩增引物：3'端是基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端的反向同源序列。 𐟒ᠨ𝽤𝓤𘎦’入片段的用量建议： - 最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数。 - 最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；0.02 㗠片段碱基对数（多片段）。 - 若插入片段太长，则建议增加载体用量。 - 若插入片段太短，则建议增加片段用量至5倍。 𐟔堤𝓧𓻥应步骤来啦： 1️⃣ 轻轻混匀各组分，避免气泡产生。 2️⃣ 将反应体系置于50℃，反应5-60分钟。 3️⃣ 反应后置于冰上冷却，然后进行转化或储存于-20℃。 ⏰ 反应时间小贴士： - 插入1-2个片段时，推荐5-10分钟。 - 插入3-5个片段时，推荐15-30分钟。 - 当载体骨架或插入片段总长超过特定值时，建议延长至30-60分钟。 𐟒ᠦœ€后，记得在50℃反应后进行瞬时离心，确保反应液收集至管底哦！

如何轻松实现无缝克隆？ 𐟔젤𘺤𚆥œ襅‹隆过程中减少突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，并使用预线性化的质粒作为模板，这样可以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。 𐟓 引物设计原则： PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列，以确保扩增产物的5'端和3'端分别与相邻片段形成重叠序列。 𐟔砦’入片段的引物设计：正向扩增引物：5'—上游载体末端正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’ 反向扩增引物：3‘—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端反向同源序列—5’ 𐟔砨𝽤𝓤𘎦’入片段、插入片段与片段连接处引物、载体反向扩增引物的设计：最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数，即0.03 pmol（单片段、多片段适用）最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 㗠片段碱基对数（多片段）单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍的用量多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时，直接使用10ng 若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50ng或高于200ng，建议按50ng或200ng用量使用线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。 𐟧ꠤ𝓧𓻥应：配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。将反应体系置于50℃，反应5~60min。将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低。插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min。当载体骨架在10kb以上或插入片段总长在4kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min。建议在50℃反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。 -20℃储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

SnapGene引物创建，超简单！ 𐟔 分子克隆和DNA序列分析的利器，SnapGene 7.0及更高版本，为您的分子生物学研究提供强大的规划、可视化和文档化工具。2020年诺贝尔奖化学奖“基因剪刀”团队的选择，您值得拥有！ 𐟓Œ 创建引物的详细步骤： 1️⃣ 打开目标序列，选择菜单中的“引物”选项，然后点击“添加引物”。 2️⃣ 将序列粘贴或键入到引物字段中，引物的结合位置将显示在下面的面板中。 3️⃣ 选择所需的引物结合位点，点击“添加引物到模板”，将引物添加到目标序列中。 4️⃣ 可以根据需要修改引序列，包括添加密码子、酶位点或短特征序列。 5️⃣ 完成引物创建后，保存目标序列和新的引序列。 𐟔砧交𞋯𜚥œ襼•物5端添加酶位点打开目标序列，选择“引物”菜单，点击“添加引物”。将序列粘贴到引物字段中。将光标放在引物的5末端，从“酶位点”下拉列表中选择一个限制性酶切位点。选择是否添加上游碱基，以确保适当的酶切。点击插入，将位点添加到引物中。 𐟓Š 查看引物：新的引将显示在目标序列上，将鼠标悬停在引物上，可以看到显示引物详细信息的工具提示。单击Save保存目标序列和新的引。 𐟒ᠦ示：任何添加都将以红色显示，新的限制性位点将被绿线注释。将鼠标悬停在该位点上以查看酶的名称。 𐟌Ÿ 快来体验SnapGene的强大功能，让您的分子生物学研究更加高效和精准！

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