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磷酸化蛋白质组学分析的四大关键步骤 磷酸化蛋白质组学是研究细胞内磷酸化修饰的强大工具,通过分析磷酸化蛋白的功能和调控机制,可以深入了解细胞信号转导的复杂网络。以下是磷酸化蛋白质组学的分析思路: 1️⃣ 磷酸化蛋白注释 通过使用GO、KEGG、KOG/COG等数据库,对磷酸化蛋白进行功能注释,可以了解这些蛋白的具体作用。此外,对磷酸化蛋白进行转录因子注释,探究哪些转录因子发生了磷酸化,也是常见的分析点。研究发现,磷酸化修饰会影响蛋白的亚细胞定位,因此进行亚细胞定位分析,看看在磷酸化的影响下,哪些蛋白改变了发挥功能的区域,也是一个重要的步骤。 2️⃣ 基本差异分析 为了了解实验组与对照组之间磷酸化修饰的变化情况,需要对鉴定到的磷酸化肽段进行定量,并利用Student’s t-test等检验方法进行组间差异分析。一般根据差异倍数FC>2,显著性检验p-value<0.05作为阈值,筛选显著变化的磷酸化肽段。针对差异磷酸化肽段来源的磷酸化蛋白,再利用GO或者KEGG数据库进行差异富集分析,以寻找差异变化的磷酸化蛋白影响到的关键调控通路。 3️⃣ Motif分析 Motif是蛋白中具有普遍性和生物学意义的氨基酸序列模式,就像是蛋白质家族的签名。磷酸化修饰是通过上游激酶识别特定的motif序列对蛋白进行磷酸化。通过对差异磷酸化位点进行motif分析和统计,可以了解激酶复杂的调控机制。例如,2019年在《Plant&Cell Physiology》杂志上发表的一篇文章中,作者对差异磷酸化肽段的motif进行统计,发现了三类保守motif,并通过体外实验验证了结果。 4️⃣ 实验设计和结果验证 ꊩ过以上步骤,可以全面了解磷酸化蛋白质组学的复杂网络和调控机制,为细胞信号转导的研究提供有力支持。
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