当前位置：网站首页 » 教程 » 内容详情

定量PCR前沿信息_实时荧光定量pcr(2024年11月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-11-28

定量PCR

[火焰]实验检测之RT-PCR检测[火焰] RT-PCR实验检测介绍实时荧光PCR（real-time PCR），属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。定量方式包括定量和相对定量。可检测mRNA，microRNA，lncRNA和DNA水平的基因拷贝数变化。服务流程 1、引物设计与合成 2、DNA/RNA抽提 3、反转录（针对RNA） 4、上机定量分析客户提供 1、全血、组织或细胞。 2、引物，或由丰核提供。 3、基因信息：目的基因名称、物种和序列（或GenBank Accession Number）。#伊莱博生物#

科研必备：RT-qPCR实验操作全攻略！实时定量PCR（RT-qPCR）是一种用于检测DNA扩增反应产物量的方法，利用荧光化学物质在每个PCR循环后测量DNA序列的增加情况。RT-qPCR广泛应用于定量分析特定DNA序列，具有高灵敏度和准确性。以下是RT-qPCR的实验操作流程：确定需要加的孔数 𐟧斥…ˆ，根据样品数、目的基因数和重复次数来计算需要加的孔数。例如，如果有4个样品和6个目的基因（包括内参），那么总共需要加4㗶㗳=72个孔。96孔板是12㗸的布局，建议按照方便记忆的方式进行布局，同一样品或同一目的基因应放置于同一行，以便后续实验操作和数据整理。实验体系 𐟧ꊥ䧩ƒ襈†qPCR的体系（每个孔里的成分）如下：有些课题组为了节省成本，会把所有成分减半，总体积10ul。将每种成分逐一加入每个孔中既繁琐又容易出错，特别是当某些成分的体积过小时，误差可能会更大。可以考虑将样品和引物分开预先配好，以10ul体系为例。上机操作 𐟖寸在进行实时qPCR实验时，首先需要将配置好的反应液加入到实时qPCR仪中。随后，设定相应的温度循环和采集模式，以便进行扩增检测。与常规PCR不同的是，real-time qPCR在扩增过程中并不需要遵循三步法（变性、退火、延伸）。考虑到产物长度通常较短（80-150 bp），一般只需进行变性和退火步骤。若使用SYBR Green等染料进行实验，完成PCR反应后应执行溶解程序，以生成溶解曲线，以便进一步评估扩增的特异性。数据分析 𐟓Š 通过分析扩增曲线和融解曲线，可以进行相对定量或绝对定量分析。相对定量用于比较不同样本中靶基因的表达差异，而绝对定量则用于准确测定样本中靶基因的拷贝数。通过以上步骤，你就能顺利完成RT-qPCR实验啦！

qPCR原理详解：实时荧光定量PCR 大家好，今天我们来聊聊qPCR（定量多聚酶链式反应）的原理。最近有点抑郁，加上药物作用，每天睡12小时，实在没精力更新。不过还是感谢大家的支持，下周有流式实验，到时候会拍操作界面的照片给大家详细讲解。 qPCR和传统PCR的主要区别在于检测方式。传统PCR只是对基因进行扩增，而qPCR则是实时检测底物的荧光强度来判断mRNA的表达量。这就引入了一个重要的概念：Ct值。在qPCR中，基因的表达与荧光强度并不是线性关系，而是指数级增长（因为DNA的扩增是2^n次方）。因此，在某个循环时，荧光强度会达到一个阈值。当荧光强度超过这个阈值时，我们认为是高表达。到达这个阈值需要的循环数越少，基因的表达量就越高。这就是图2中曲线含义的解释（图片来源：Merck）。有人可能会问，既然是mRNA的表达量，为什么说是DNA的扩增呢？这就要提到mRNA和cDNA的概念。空气中存在RNA酶，所以RNA在正常条件下极不稳定。即使是RNA-seq，也需要将RNA逆转录为cDNA。在生物学中，我们一般认为这两者的表达是一致的。篇幅有限，下次再讲操作流程（RNA提取和引物设计等）。感谢大家的支持。

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

PCR实验Ct值：扩效关键在荧光定量PCR实验中，Ct值的分析至关重要。PCR扩增效率（En）是评估实验结果的关键参数，表示聚合酶将待扩增的DNA分子转变为扩增子的效率。正常情况下，1个DNA分子转变为2个DNA分子的扩增效率为100%。En的正常范围通常在90%-110%之间，超出此范围可能影响Ct值的准确性。影响En的因素有很多，包括但不限于： 𐟔젥应条件：温度、时间等。 𐟧젥𜕧‰騮𞨮᯼š特异性、浓度等。 𐟧ꠥꌧŽ異ƒ：污染、仪器性能等。在决定是否外包实验前，许多人会担心成本问题，但实际上，外包实验的优势不容忽视： 1️⃣ 时间缩短：外包团队通常拥有更高效的实验流程，可以大大缩短实验时间。 2️⃣ 数据可靠性：外包团队通常具备更专业的实验设备和经验，能够确保数据的真实可靠性。 3️⃣ 持续支持：外包团队不仅提供实验服务，还能提供持续的科研支持，帮助研究人员更好地理解和分析实验结果。选择合适的团队进行实验外包，不仅可以显著降低科研成本，还能提升SCI发表速度，从而申请更多经费，实现晋升加薪的良性循环。实验外包的普及并非没有原因，只要选择得当，外包实验可以成为科研工作中的有力助手。

荧光PCR新手必看！要点汇总荧光定量PCR是一项精密的实验技术，需要专业人员操作。以下是操作过程中需要注意的要点，以确保实验的可靠性和可重复性。 𐟏력ꌥˆ†区：确保试剂准备间、样本处理间、PCR室和电泳间有明确的区分，各房间的实验服不得混用。 𐟧꠨‰‚准备与处理：试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度核酸模板，如高浓度的标准品、PCR产物和miRNA的minics。 𐟚𖢀♂️ 减少走动：尽量减少频繁的走动，尤其是去过电泳间后，当天不可进入其他房间。 𐟛᯸ 生物安全柜使用：使用生物安全柜加样，不同位置的移液器不可混用，不要随意更换其位置。 𐟧𜠦𑡦Ÿ“预防：在检测体系中添加UNG酶系统，用于避免PCR产物的污染。 𐟧꠨‰‚质量控制：对每批次配制或购买的试剂进行质检，保证试剂的性能稳定可控，均一。 𐟧𔠧绦𖲥™覓作：使用结束后调整至最大量程，取样时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间，避免外壁沾过多试剂随加样进入导致重复性不好。 𐟧𞠥应液配制与加样：加样使用合适量程的移液器；对于较小体积的移液，取液时不可深入液体太多以免试剂沾到吸头外壁至移液量不准确，深入1-2mm即可（尤其是粘稠试剂，如酶、甘油等）。小体积试剂加样务必取液后眼观是否取到液体，加样务必浸入混合液一下吹吸数次，弃吸头前眼观确定吸头中无残留。 𐟧𞠥应液分装：反应液分装前必须混匀（比如涡旋震荡或移液器吹吸混匀），反应液第一个孔分装必须润一下枪头，96孔之间加样间隔时间尽量保持一致，96孔的点样位置尽量保持在96孔的相同位置，复孔之间尽量相邻点样，点样按照一定的顺序，吸取时枪头深入页面的深度尽量一直保持在1-2mm之间。加样使用移液器镶紧移液器吸头，每次按至第一档即可，不可按至第二档，避免气泡产生和加样不准确。加样尽量匀速，不要加样到孔外面以免对后面封膜造成影响。点样结束后，观察是否有漏加样本或加错样本。通过以上注意事项，可以有效保证荧光定量PCR实验的准确性和可靠性。

5种常见溶解曲线错误及解决方法大家好，今天我们来聊聊荧光定量PCR（qPCR）中常见的五种溶解曲线错误及其解决方法。溶解曲线下滑 𐟓‰ 当溶解曲线的平台期出现得太晚，求导时可能会出错。这通常是因为产物过长或GC含量过高导致的。解决方法是更换引物，避开高GC序列，选择较短产物的引物。宽峰问题 𐟏ž️ 有时你会发现溶解曲线的峰比其他人跑出来的要“胖”，但又是单峰。这其实是宽峰由几个峰叠加形成，出现了与产物TM值相近的非特异性产物。解决办法是重新设计引物，并在NCBI上进行Blast比对，选择特异性好的引物。双峰现象 𐟏”️ 当非特异峰出现在特异峰左侧时，可能是扩增出引物二聚体；当非特异峰出现在特异峰右侧时，则是出现了非特异性产物。解决方法首选重新设计引物，或者降低引物用量，更改实验程序。阴性对照起峰 𐟌꯸ 如果实验结果中发现阴性对照（NTC）起峰，不要慌张，这并不意味着引物不能用。查看实验样品的溶解曲线，如果只有一个产物特异峰，说明引物二聚体会在没有模板时产生，加入模板后，引物二聚体的产生会受到抑制。无溶解曲线 𐟚늦œ‰时你可能发现结果中只有扩增曲线，没有溶解曲线。这可能是因为仪器没有设置溶解曲线的程序。不同仪器的溶解曲线程序可能有所不同，需要手动添加。溶解曲线的原理 𐟌᯸ qPCR程序结束后，将温度升到95℃，DNA开始解链，DNA的小沟区域也逐渐消失，SYBR Green从小沟区域释放出来，荧光信号值开始逐步降低。当温度达到产物解链一半时的温度，即Tm值时，SYBR Green大量游离出来，荧光信号值会突然下降达到0，这就是溶解曲线的来源。原始曲线进行导数分析后，溶解曲线会变成一个峰。了解这些原理后，你就能更快地解决上述问题了。溶解曲线的Tm值是溶解曲线中的重要参数，在使用同一qPCR试剂下，目标基因溶解曲线的Tm值由其产物长度和GC含量决定。只要不改变qPCR试剂，其TM值不会发生改变。因此，如果引物不会扩增出非特异性产物，就只会有一个峰；存在多个非特异性产物时，就会有多峰的情况产生。

taq 嘿，基因工程的期末考试快到了，真是让人头大！今天我们来聊聊SYBR和TaqMan这两种常见的实时荧光定量PCR技术，顺便给大家一些复习的小贴士。 SYBR技术：简单粗暴的定量方法 𐟓ˆ SYBR技术其实是利用一种叫SYBR Green I的染料来检测PCR产物的。这个染料有个特别的地方，就是它只和DNA双链的小沟结合，而且结合后荧光信号会成百倍地增加。所以，PCR产物越多，荧光信号就越强。这样一来，我们就可以通过检测荧光信号的强度来定量任何目的基因了。 TaqMan技术：高精度的定量神器 𐟔 TaqMan技术就复杂一点，但也很有意思。它的核心是利用Taq酶的5'外切酶活性来裂解双链DNA的5'端核苷酸。这个过程中，一个特制的探针（也叫外切核酸酶探针）会和目的基因特异性杂交。这个探针的5'端标记了报告基团（荧光基团），3'端标记了淬灭基团。正常情况下，两个基团离得很近，构成了FRET（荧光共振能量转移）关系，所以荧光基团被淬灭，我们只能检测到3'端的荧光信号。当PCR扩增到探针结合的位置时，Taq酶就会利用5'外切酶活性把探针5'端的荧光分子从探针上切割下来。这样一来，FRET被破坏，荧光基团发出荧光。切割下来的荧光分子数量和PCR产物的数量成正比。所以，根据PCR反应体系中的荧光强度，我们就能算出初始DNA模板的数量了。复习小贴士：名词太多怎么办？ 𐟓š 说实话，这些名词听起来确实有点晕头转向。不过别担心，考试的时候会有些规律可循的。比如，SYBR和TaqMan这两种技术的原理虽然不同，但它们都是通过检测PCR产物的荧光信号来定量基因的。记住这一点，再结合一些具体的实验操作步骤，应该就能顺利过关啦！希望这些信息能帮到大家，祝大家考试顺利！𐟒ꀀ

探索中国药科大学的隐秘角落 𐟏늤𝠨ƒ𝦉𐨿𞥈™是药科大学的哪个角落吗？余秋已去，凛冬来临，暖阳照拂，岁终渐近。用照片定格余秋，你想到这是哪里了吗？即将开始的12月，你也许会经历人生最重要的考试。那请你加油，全力以赴的努力，像这美丽的风景一样，绽放~ 𐟔젧—…理服务：包埋，切片，组织芯片制作，HE，Masson，油红，AB-PAS，番红固绿，天狼猩红等特殊染色。 𐟔젥ˆ†子病理：免疫组化，免疫荧光单标/双标/多标。 𐟔젦˜𞥾像：全景扫描，扫描/透射电镜。 𐟔젗B及PCR：Western blot检测，荧光定量PCR检测。 𐟐�Š觉饏Š实验：动物饲养，动物造模，动物饲料，动物课题，ELISA检测，血常规，生化检测。 𐟧꠨‰‚及耗材：抗体，ELISA试剂盒，染色液，固定液，脱钙液，常规耗材等。 𐟓𘠥🃨„HE 𐟓𘠨‚𚈅 𐟓𘠨‚脏HE 𐟓𘠨„𞨄HE 𐟓𘠨‚𞨄HE 𐟓𘠧œ𜧐ƒHE 𐟓𘠩𜻥퐈E 𐟓𘠨ƒŽ鼠HE 𐟓𘠨„‘HE 𐟓𘠨‚ HE 𐟓𘠧š䈅 𐟓𘠨ဧE 𐟓𘠧‘ž士卷HE 𐟓𘠨†关节HE 𐟓𘠨ƒ𐨅𚈅 𐟓𘠍asson 𐟓𘠧•ꧺ⥛𚧻🊰Ÿ“𘠥䩧‹𜧌駺⊰Ÿ“𘠁B-PAS 𐟓𘠦𒹧𚢀

如何设计qPCR引物：实用指南大家好！今天我们来聊聊如何设计qPCR（定量PCR）的引物。其实，qPCR的引物设计和普通PCR差别不大，都可以用NCBI来方便地设计。不过，由于qPCR鉴定的是mRNA的表达，所以在设计引物时需要特别注意以下几点：第一步：打开NCBI 首先，打开NCBI（美国国立生物技术信息中心）网站，搜索你需要的基因（例如Lepr）。第二步：找到基因卡片点开基因卡片，找到最下方的mRNA和Protein描述。根据你的需求选择合适的Isoform，然后复制NM码。第三步：进入引物设计页面在NCBI的引物设计（Primer design）栏目输入刚才复制的NM码。我个人更喜欢下载cDNA文件，然后用SnapGene手动拉取引物，这样可以直接看到cDNA序列，更加直观。第四步：确认引物CG值在SnapGene中确认引物的CG值（大约50%），Tm值在60度左右。可以多设计几对引物，以防有些引子不工作。希望这些小技巧能帮到大家，祝科研顺利！𐟒ꀀ

专栏内容推荐

3200 x 2000 · jpeg
miRNA定量PCR检测-研载生物科技（上海）有限公司
素材来自:yihaowan.com.cn
700 x 1050 · jpeg
实时荧光定量PCR仪-天津大学生命科学学院
素材来自:smxy.tju.edu.cn

1500 x 1500 · png
ABI QuantStudio 1 Plus实时荧光定量PCR仪_参数_价格-仪器信息网
素材来自:instrument.com.cn
3714 x 2273 · jpeg
CytoCt™ RT-qPCR System | 易锦生物
素材来自:igenebio.com

750 x 750 · jpeg
博日 FQD-96C PCR定量pcr仪产品参数
素材来自:b2b.baidu.com
549 x 598 · jpeg
Q1000+Q1000+型荧光定量PCR系统-郑州博邦科贸有限公司
素材来自:hn-17.com

753 x 220 · jpeg
リアルタイム定量PCR（qPCR）解析 | 和研薬株式会社受託オンライン
素材来自:wakenyaku.co.jp

1512 x 1512 · jpeg
CFX Opus 96 实时荧光定量 PCR仪基因扩增仪_美国伯乐pcr仪基因扩增仪-上海旦鼎国际贸易有限公司
素材来自:chem17.com
1503 x 1233 · png
QP-1602/QP-3204 荧光定量PCR仪 | PCR仪 | 产品中心 | LabYeah—创新实验室仪器|官网
素材来自:labyeah.com

1280 x 463 · png
带你了解荧光定量PCR、数字PCR的技术与光学原理解决方案_福州创安光电科技有限公司
素材来自:visionlens.com

1280 x 960 · jpeg
ABI 7500 ABI_7500荧光定量PCR仪-化工仪器网
素材来自:chem17.com
3648 x 2736 · jpeg
ABI QuantStudio Dx 荧光定量PCR仪-科淘-科服网tten.cn
素材来自:ketao.tten.cn

750 x 750 · jpeg
美国伯乐CFX Opus 96实时荧光定量PCR仪_伯乐CFX Opus 96 PCR-孚约生物科技（上海）有限公司
素材来自:chem17.com
2128 x 2128 · jpeg
CFX Opus 96 实时荧光定量 PCR仪基因扩增仪_美国伯乐pcr仪基因扩增仪-上海旦鼎国际贸易有限公司
素材来自:chem17.com

930 x 930 · jpeg
荧光定量PCR仪-基因扩增仪-实时荧光定量PCR-国产PCR仪价格-苏州阿尔法生物
素材来自:bioalpha2008.com
791 x 757 · jpeg
ABI QuantStudio 1价格-ABI QuantStudio1实时荧光定量PCR仪QS1现货_ABI 7500荧光定量pcr仪-上海 ...
素材来自:chem17.com

845 x 787 · png
CFX Opus96总代理-Bio-Rad伯乐CFX Opus96荧光定量PCR仪_Bio-Rad pcr仪-上海普瑾医疗科技有限公司
素材来自:chem17.com
636 x 790 · jpeg
StepOnePlus/StepOne-赛默飞ABI StepOnePlus荧光定量pcr仪-上海剑凌信息科技有限公司
素材来自:foodjx.com

2976 x 3968 · jpeg
定量PCR仪-1 - 仪器详情
素材来自:lifetech.ustc.edu.cn
2000 x 2000 · jpeg
SuperRT III一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒-染料法
素材来自:biosharp.cn

600 x 230 · jpeg
荧光定量PCR、数字PCR技术与光学原理解决方案 - 知乎
素材来自:zhuanlan.zhihu.com

800 x 800 · jpeg
Celemetor实时荧光定量PCR分析系统
素材来自:yeasen.com
335 x 593 · jpeg
Thermofisher ABI Q3定量PCR仪_Thermo ABI仪器核心区-上海艾研生物科技有限公司
素材来自:chem17.com

826 x 844 · png
Roche罗氏专用-LightCycler480/96荧光定量PCR仪384孔pcr板_-上海剑凌信息科技有限公司
素材来自:chem17.com
1000 x 1000 · jpeg
定量PCR仪-价格-采购-供应商信息-丁香通
素材来自:biomart.cn

1029 x 467 · jpeg
达安科普：详解新冠核酸快速检测PCR技术的三代不同！
素材来自:k.sina.cn

808 x 606 · png
荧光定量PCR仪
素材来自:imis.ahu.edu.cn
2933 x 2099 · png
定量的PCR （qPCR） 2/2 定量的PCRのプロトコル | リケラボ｜生物実験テクニック
素材来自:rikelab.jp

1080 x 810 · jpeg
实时荧光定量PCR(qPCR)_第三方检测机构_中科光析科学技术研究所
素材来自:bjhgyjs.cn
489 x 710 · png
数字PCR的数学原理及系统间相互比较-深圳市恩科生物科技有限公司
素材来自:antpedia.com

500 x 500 · jpeg
TP950实时荧光定量PCR仪(TP950) - 上海启步生物科技有限公司 - 化工设备网
素材来自:ccen.net
984 x 737 · jpeg
实时荧光定量PCR仪
素材来自:chembic.nju.edu.cn

783 x 625 · png
铁死亡检测-外泌体鉴定-实时荧光定量PCR-研载生物科技（上海）有限公司
素材来自:yihaowan.com.cn
2083 x 2083 · jpeg
7500定量PCR仪-科至达（北京）信息技术有限公司
素材来自:chem17.com

1609 x 2176 · jpeg
MA-3200型32孔实时荧光定量PCR扩增仪价格,详情介绍-960化工网 – 960化工网
素材来自:chem960.com

素材来自:查看更多內容

当前用户设备UA：Mozilla/5.0 AppleWebKit/537.36 (KHTML, like Gecko; compatible; ClaudeBot/1.0; +claudebot@anthropic.com)