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重叠pcr前沿信息_重叠pcr连三个片段(2024年11月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-11-28

重叠pcr

三分钟搞懂T4法构建载体的三种变式连接今天我们来聊聊T4法在构建载体时的三种变式连接。T4法常用于空载体的改造，通过两种内切酶将质粒DNA切开，产生带有黏性末端的线性化载体。目的片段通常是合成的小片段DNA分子，长度通常在100bp以下。首先，我们来说说环PCR。环PCR的点突变一般只能引入60bp以下的序列。具体来说，60bp中，20bp作为扩增序列，40bp是额外添加的5’端附加序列，其中需要包含一段同源臂，真正能引入的大概只有40-45bp的额外序列。很少看到有人把PCR使用的引物设计到60bp以上。接下来是无缝克隆。无缝克隆在载体骨架上引入100bp左右的小片段更是一种灾难。无缝克隆酶主要包含三种核心功能酶：5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。其中5’端核酸外切酶的功能远比大家想象的更加强大。虽然我们讲同源臂加20bp左右的序列，但其实5’端核酸外切酶远不止切割掉这20bp左右的同源臂，个人认为切割长度起码在60bp以上。左右各切60bp的话，我们合成的100bp的DNA分子其实已经被切碎了，自然不可能连接到载体上。所以，我们只能通过T4法将80-150bp的短小DNA序列插入载体骨架。具体设计方式如上图所示。下一期，我们将探讨一种被称为“玄学”的技术——搭桥PCR或重叠PCR。这是我以前做分子克隆时第一个感觉玄学的实验，当然到现在我自认为已经非常精通其原理，但仍感觉其相当玄学。关注我，我们一起领略科研背后的底层逻辑！

𐟧쨴觲’点突变实验全攻略✨ 在探索基因奥秘的旅途中，点突变技术可是个得力助手！𐟔 通过这种技术，我们可以精确地改变基因中的特定结构，比如酶活位点、修饰位点，来研究它们在蛋白功能中的关键作用。𐟒᠊ 今天，就让我们一起来学习两种实验室常用的点突变方法吧！𐟑颀𐟔슊1️⃣ 一步法快速定点突变（以质粒为模板）𐟒‰ 这种方法超级快捷，只需一步就能完成定点突变，是科研工作中的好帮手！ 2️⃣ 搭桥法（重叠延伸PCR技术）𐟌‰ 搭桥法通过巧妙地设计引物，能够精确地将多个突变点组合在一起，非常适合需要同时改变多个位点的实验。掌握这些方法，你就能轻松搞定基因定点突变实验啦！𐟎‰ 快来试试吧！

𐟧쳲-无缝克隆操作指南 𐟔젤𘺤𚆦升克隆效率并减少突变，推荐使用高保真PCR Mix来扩增DNA。同时，预线性化的质粒作为模板是更好的选择哦！ 𐟓 引物设计小技巧： - PCR引物的5'端，要包含与相邻片段同源的15-25nt序列，推荐18nt，确保扩增产物能与相邻片段形成重叠。 𐟓 插入片段的引物设计如下： - 正向扩增引物：5'端是上游载体末端的正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列。 - 反向扩增引物：3'端是基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端的反向同源序列。 𐟒ᠨ𝽤𝓤𘎦’入片段的用量建议： - 最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数。 - 最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；0.02 㗠片段碱基对数（多片段）。 - 若插入片段太长，则建议增加载体用量。 - 若插入片段太短，则建议增加片段用量至5倍。 𐟔堤𝓧𓻥应步骤来啦： 1️⃣ 轻轻混匀各组分，避免气泡产生。 2️⃣ 将反应体系置于50℃，反应5-60分钟。 3️⃣ 反应后置于冰上冷却，然后进行转化或储存于-20℃。 ⏰ 反应时间小贴士： - 插入1-2个片段时，推荐5-10分钟。 - 插入3-5个片段时，推荐15-30分钟。 - 当载体骨架或插入片段总长超过特定值时，建议延长至30-60分钟。 𐟒ᠦœ€后，记得在50℃反应后进行瞬时离心，确保反应液收集至管底哦！

如何轻松实现无缝克隆？ 𐟔젤𘺤𚆥œ襅‹隆过程中减少突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，并使用预线性化的质粒作为模板，这样可以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。 𐟓 引物设计原则： PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列，以确保扩增产物的5'端和3'端分别与相邻片段形成重叠序列。 𐟔砦’入片段的引物设计：正向扩增引物：5'—上游载体末端正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’ 反向扩增引物：3‘—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端反向同源序列—5’ 𐟔砨𝽤𝓤𘎦’入片段、插入片段与片段连接处引物、载体反向扩增引物的设计：最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数，即0.03 pmol（单片段、多片段适用）最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 㗠片段碱基对数（多片段）单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍的用量多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时，直接使用10ng 若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50ng或高于200ng，建议按50ng或200ng用量使用线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。 𐟧ꠤ𝓧𓻥应：配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。将反应体系置于50℃，反应5~60min。将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低。插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min。当载体骨架在10kb以上或插入片段总长在4kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min。建议在50℃反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。 -20℃储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

布里斯托大：研究ABCC9突变 𐟎“ 研究方向：ABCC9突变与心源性猝死风险 𐟓… 学制：1年 𐟓… 申请截止时间：无 𐟌 工作语言：英语 𐟎“ 所需学位：本科 𐟏렦œ𚦞„介绍：布里斯托大学，简称布大，成立于1876年，是位于英格兰西南部城市布里斯托的世界百强名校。布大属于红砖大学、罗素大学集团、科英布拉集团、世界大学联盟、国际大学气候联盟和欧洲大学协会成员。根据2023年QS世界大学排名，布大位列第61名；2020年软科世界大学学术排名中，布大排名第64名；2023年泰晤士高等教育世界大学排名中，布大排名第76名；2021年U.S. News世界大学排名中，布大排名第86名。 𐟓‹ 项目描述：心源性猝死 (SCD) 是一个重要的临床问题，对死者的亲属具有持久影响，尤其是在婴儿期猝死时。已知心脏离子通道和转运蛋白基因的突变会导致易发生猝死的遗传病症。然而，在许多情况下，筛选候选基因的突变要么不会显示阳性结果，要么会产生“意义不明的变异”(VUS)。将错义变异分类为 VUS 会带来一个特殊的问题，因为如果没有明确的功能分析，VUS 就不能用于临床诊断。几种不同的钾通道基因与遗传性心律失常和 SCD 有关。心脏 K ATP通道（由 Kir6.x 和 SUR2 共同组装形成）被认为在代谢应激条件下很重要，此时细胞内 ATP 水平下降。由此产生的 K ATP通道激活可缩短心室动作电位并防止 Ca 2+ i过载和心律失常。另一方面，异常的 K ATP激活本身可能会导致心律失常风险增加。最近，在婴儿猝死中发现了ABCC9的功能获得性突变；ABCC9编码 K ATP的 SUR2A 亚基通道。错义 SUR2A 突变也与以心室复极化缩短为特征的重叠心律失常综合征有关。 𐟎›‡和目的：已知 A355S 突变会增加 K ATP通道 (Kir6.2+SUR2A) 电流。目标 1 是确定包含 R661C 和 R663C SUR2A 变体的通道是否也表现出 K ATP通道功能的增加。目标 2 是测试临床使用的磺酰脲类格列本脲的作用，以确定该药物是否可以减轻任何功能获得作用。该项目的发现应有助于更好地理解 SUR2A 突变作为心律失常和猝死诱发因素的作用。 𐟔젦Š€术：该项目将使用实验室已经建立的各种技术，包括：分子生物学：PCR、诱变、克隆、质粒纯化等。细胞培养和瞬时转染：异源细胞系）。离子通道功能：全细胞膜片钳电生理学和离子通道药理学。

考研生物？这些前置条件你准备好了吗？ 𐟓š 成绩不挂科首先，成绩得好看！挂科可不是小事，导师在选学生时可能会问你为什么挂科，所以尽量别让成绩拖后腿。如果已经挂科了，记得补考一定要过。 𐟓˜ 英语四级六级英语四级至少得过，因为研究生期间要读大量英文文献。虽然有些学校毕业对四六级没要求，但在考研和找导师时，四六级成绩还是很重要的。 𐟔젧瑧 ”能力科研能力包括实验技能和科研思维。现在越来越多的学校在面试时考察这两方面。建议大家提前规划好研究方向，尽量让毕业设计和未来方向重叠。如果实在不能重叠也没关系，可以学一些通用的基本科研技能，比如PCR、琼脂糖凝胶电泳、提RNA、构建载体、SDS-PAGE等。 𐟒ᠥ‚加大创项目尽量在本科期间参加一些大创项目，不是为了做实验机器人，而是要带着思考能力，对整个项目有个把控，知道自己在做什么。这样在研究生面试时才能更有优势。 𐟓… 提前开始毕业设计如果错过大创，可以提前开始毕业设计，选择一些比较贴近自己报考方向的项目。 𐟌 跨专业考生导师对跨专业考生的包容度较高，但跨考生需要掌握生物学各种实验的理论知识。有条件的同学可以去生物学实验室学习一些基本操作，尽量减小和本专业学生的差距。希望这些建议能帮到正在准备考研生物的你们！加油！𐟒ꀀ

荧光PCR探针技术全解析（上） 𐟔 探针的奥秘在PCR扩增的过程中，除了常规的引物，我们还会加入一种特异性的荧光探针。这个探针通常是一条寡核苷酸，两端分别标记了一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团或受体基团。 𐟌ˆ 荧光共振能量转移的原理荧光共振能量转移（FRET）是荧光PCR的核心原理。如果两个荧光基团的发射光谱与吸收光谱有重叠，当它们距离足够近时，供体被激发光激发后，能量会转移给受体，而不是发出荧光。 ➡️ 探针的种类 Taq-Man探针：这是一种线性的探针，标记在同一条寡核苷酸上，序列较短。在PCR扩增过程中，当探针完整地结合在DNA单链上时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。随着PCR的进行，TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性将探针水解，使得报告基团和淬灭基团分离，从而发出荧光。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此通过检测荧光强度可以监测PCR产物的扩增量。双杂交探针：这种探针在两条寡核苷酸上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团。两条探针都可以与扩增产物杂交，但杂交位置不同但很接近。反应时，两条探针一头一尾杂交于扩增产物上，使得两个基团距离在10nm以内（一般1-5碱基），此时产生荧光共振能量转移现象，激发光下供体基团不发光，受体基团发光，检测受体基团的发光情况即可确认扩增产物的情况。分子信标探针：这种探针通常有一个茎环结构，茎部序列与目标DNA互补，环部序列则包含报告基团和淬灭基团。在未结合目标DNA时，环部被茎部束缚，无法发出荧光。当结合目标DNA后，茎部打开，环部暴露出来，发出荧光。蝎形探针：这种探针设计巧妙，可以同时检测多个位点。它通常包含一个公共茎部和一个环部序列，环部序列可以与多个目标DNA结合。当结合目标DNA后，公共茎部打开，环部暴露出来，发出荧光。 𐟔젦Ž⩒ˆ的选择在选择探针时，需要考虑其特异性、灵敏度和对实验条件的要求。每种探针都有其独特的优势和适用范围，具体选择要根据实验需求来定。 𐟓ˆ 实时监测PCR进程通过监测荧光的强度变化，我们可以实时监测PCR的进程和产物的扩增量。这种方法不仅提高了实验的准确性，还大大缩短了实验时间。 𐟔젤𘴥𚊨–�„应用在临床诊断中，荧光PCR技术因其特异性强、灵敏度高而得到广泛应用。它可以帮助医生更准确地诊断疾病和评估治疗效果。

𐟔젥𜕧‰騮𞨮᥅覔𛧕导š从基础到高级技巧引物是PCR反应的核心，其设计直接影响扩增的特异性和效率。以下是设计引物时需遵循的关键步骤和原则：选择保守区：𐟌 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。通过比较不同物种的同一基因，确定保守区，这有助于提高扩增的特异性。控制引物长度：𐟓 引物长度通常在15-30bp之间，理想长度为20bp。过长的引物可能导致延伸温度过高，不利于Taq DNA聚合酶的反应。优化G+C含量：𐟌€ G+C含量应保持在40-60%之间。G+C含量过低会影响扩增效果，而过高则可能导致非特异条带。ATGC应随机分布，避免连续的嘌呤或嘧啶核苷酸序列。调整Tm值：𐟌᯸ 引物的Tm值应在55-65℃之间，上下游引物的Tm值差异不应超过5℃。计算Tm值时，可以使用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）。避免自身互补：𐟚력𜕧‰騇꨺뤸能有连续4个碱基的互补，以防止形成发夹状结构（Hairpin），这种结构会阻碍引物与模板的结合。防止引物间互补：𐟔„ 引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3’端的互补重叠，以防形成引物二聚体。修饰5’端：𐟌Ÿ 引物的5’端可以修饰，这通常不会影响扩增的特异性。修饰包括添加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等，甚至引入蛋白质结合DNA序列或突变序列。通过遵循这些原则，您可以设计出高效且特异性的PCR引物，为科研实验提供可靠的基础。

合成生物学之DNA合成组装

C105摊位数公布第105届ComicMarket （C105）摊位数情报公布部分IP分区社团数以及部分IP分区配置分布图数据来源：Comike webcatalog *目前为官方公开的初版，存在一定时效性 *未被官方设立专区的IP被归类在综合区 *其他被包含在综合区里的IP将稍后整理总体 28763 【IP专区】蔚蓝档案 2290 马娘 1080 偶像大师 948 型月 804 东方 704 舰C 596 lovelive 326 SE系列(FF、QD等) 182 高达 171 刀剑乱舞 130 碧蓝航线 104 少女与战车 90 TIGER&BUNNY 48 柯南 42 *摊位数【综合区】 Vtuber 2014 互联网社交游戏 1582 cos 1120 Digital 634 *摊位数【网游区部分IP】原崩铁零 655社团 (社团推出作品重叠且无序，统一为米哈游街道) 明日方舟 236社团妮姬 159社团 pcr 50社团 pjsk 46社团 gbf 37社团少女前线 35社团爱丽丝机甲 21社团影之诗 16社团 PSO2 7社团灰烬战线 6社团鸣潮 5社团勇气之剑 4社团御城Project 4社团重返未来1999 3社团雀魂 3社团无期迷途 2社团英雄联盟 2社团龙约 2社团神巴 2社团世界弹射物语 2社团 mememori 2社团幻塔 1社团深空之眼 1社团尘白禁区 1社团 *此部分为社团数

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