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设计引物最新视觉报道_设计引物的原则(2024年12月全程跟踪)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：热点更新日期：2024-12-02

设计引物

qPCR引物设计指南：轻松搞定引物设计！大家好！最近是不是想我了？我回来啦！这段时间确实有点忙，发生了不少事情，但不管怎样，还是继续给大家带来实用的小技巧吧！今天我们来聊聊qPCR引物设计的那些事儿。首先，做qPCR的第一步就是设计引物。市面上有很多设计引物的软件，但今天我要推荐一个我个人觉得非常好用且方便的软件——MRPrimerW2。这个网站支持九种物种的引物设计，简直是科研神器！使用方法也很简单。你可以通过输入基因名或者fasta序列格式来设计引物。而且，这个网站还支持一次性输入多个基因，一次性设计出很多基因的引物，简直不要太方便！更棒的是，这个网站还提供了自定义设置，方便我们设计出自己想要的引物。设计完之后，只需要点击primer search，就能检索到你想要的引物。结果出来后，每个基因都会有相应的引物。你可以选择top 1、top 10或者top 50的引物评分来呈现结果。最后，别忘了在NCBI上进行复查，确保引物的准确性。是不是觉得省时省力又省钱？祝大家科研顺利，结果完美！科研嘛，信其有不信则无，但有了好的工具和方法，成功的几率总是大一些的。加油！𐟒ꀀ

𐟧쨴觲’点突变实验全攻略✨ 在探索基因奥秘的旅途中，点突变技术可是个得力助手！𐟔 通过这种技术，我们可以精确地改变基因中的特定结构，比如酶活位点、修饰位点，来研究它们在蛋白功能中的关键作用。𐟒᠊ 今天，就让我们一起来学习两种实验室常用的点突变方法吧！𐟑颀𐟔슊1️⃣ 一步法快速定点突变（以质粒为模板）𐟒‰ 这种方法超级快捷，只需一步就能完成定点突变，是科研工作中的好帮手！ 2️⃣ 搭桥法（重叠延伸PCR技术）𐟌‰ 搭桥法通过巧妙地设计引物，能够精确地将多个突变点组合在一起，非常适合需要同时改变多个位点的实验。掌握这些方法，你就能轻松搞定基因定点突变实验啦！𐟎‰ 快来试试吧！

生物科学专业必备电脑配置清单𐟓‹ 大家好！作为即将踏入生物科学领域的小伙伴们，选择一台适合自己的电脑至关重要。今天，我们来聊聊哪些电脑配置更适合我们的专业需求。 𐟓Š 日常需求在学习过程中，我们会用到各种工具来辅助完成任务，例如： Office三件套（Word, Excel, PowerPoint）：用于撰写论文、处理实验数据和准备演讲课件。文献管理软件Endnote：用于收集、管理和引用文献资料。数据分析软件（如SPSS、Origin、GraphPad Prism）：帮助我们进行统计分析和图表制作。分子生物学软件SnapGene：进行DNA序列编辑和设计。基因分析软件Primer：用于设计引物和分析基因片段。化学绘图软件ChemDraw和KingDraw：绘制化学结构式。医学影像处理软件Mimics：用于三维重建和模型分析。编程语言（如C语言、Java、Python）：对于研究中的数据处理和建模工作非常重要。 𐟒𛠧ᬤ𛶩…置建议为了保证这些软件能够顺畅运行，我们需要关注以下几个硬件参数： CPU：中央处理器是电脑的大脑，对于运行复杂软件来说至关重要。推荐选择至少具有2.5GHz基础频率，且可以睿频至4.4GHz以上的处理器。核心数至少为六核，如果预算允许，八核或更多会更好。内存：由于我们常常需要同时打开多个程序，所以至少需要16GB的RAM。这样可以避免电脑因内存不足而卡顿。存储：建议选择512GB或更大容量的固态硬盘（SSD），最好是支持PCIe或NVMe协议的高速SSD，以保证文件读写速度快，系统运行流畅。显示屏：考虑到我们需要长时间盯着屏幕，因此建议至少选择15.6英寸大小的显示器，并且分辨率至少达到1080p（Full HD），更高分辨率如2K会更加清晰舒适。接口：确保你的电脑至少有两个USB 3.0端口，以便于连接外部存储设备或其他硬件。电源：选择80W或90W的大容量电池，以保证长时间的续航能力。 ⚠️ 注意事项最后，虽然Mac电脑在设计上很出色，但对于一些特定的生物科学软件可能存在兼容性问题，所以在选择时要慎重考虑。希望这份指南能帮助大家挑选到最适合自己的电脑！如果你觉得这篇文章对你有所帮助，请给一个小小的点赞作为支持哦！

内参基因是什么意思大家好，我想请教一下关于QPCR中内参基因和目的基因的问题。最近我在做实验时发现，内参基因的Ct值一般在29-30之间，而目的基因的Ct值在18-20之间。内参基因的Ct值明显高于目的基因，这让我有点困惑。我查阅了一些资料，发现内参基因通常用于校正实验误差，确保目的基因表达量的准确性。然而，如果内参基因和目的基因的Ct值差异过大，可能会影响实验结果的可靠性。有没有哪位大神能告诉我，这种情况是否正常？如果内参基因和目的基因的Ct值差异大，应该怎么处理？是否需要重新设计引物或者调整实验条件？期待大家的宝贵意见，谢谢！𐟙

载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

PCR新手必看！细节制胜𐟒ꊥ˜🯼ŒPCR新手们！刚开始做PCR实验可能会有点手忙脚乱，但别担心，我来给你们分享一些小贴士，帮你们顺利上手。实验设计 𐟓 在开始实验之前，一定要仔细设计你的实验方案。确定你要扩增的目标、引物和探针的序列，优化反应条件和参数，别忘了设计阳性和阴性对照。避免杂交污染 𐟧슐CR实验特别敏感，很容易受到外源性DNA污染的影响。所以，所有操作都必须在无RNA/DNA污染的环境中进行。使用专用的实验室空间、一次性耗材、滴管，确保样品和试剂的纯净性。选择高质量试剂 𐟧ꊨ‰‚和酶的选择非常关键，一定要选高质量的，以确保PCR反应的可靠性和重复性。储存试剂和酶的温度也要符合要求，防止它们失活。引物和探针设计 𐟔犥ˆ理设计引物和探针是成功的关键。确保它们具有良好的特异性，避免二聚体形成，优化浓度和配对。样本处理 𐟍ƒ 从样本中提取DNA或RNA时，务必遵循最佳的样本处理方法。确保样本质量和纯度，避免污染和降解。正负对照 ✅ 在PCR实验中，始终包括阳性和阴性对照。阳性对照是已知含有目标序列的样品，阴性对照是不含目标序列的样品。这可以帮助你验证PCR反应的可靠性和特异性。选择高质量PCR管和耗材 𐟧𜊤𝿧”詫˜质量的PCR管和耗材，以确保PCR反应体系的稳定性和一致性。避免重复使用PCR管和耗材，以防止污染和交叉反应。温度设置 𐟌᯸ 根据引物和探针设计，在PCR实验中适当设置温度。确保扩增温度、退火温度和延伸温度等参数都经过优化。实验记录 𐟓Š 对每个实验进行详细记录，包括实验日期、试剂批次号、样品信息、实验条件和结果。这将有助于追溯实验过程和结果的准确性。数据分析 𐟓ˆ 正确分析PCR结果，包括CT值、曲线图和荧光信号。根据实验设计和目的，选择适当的数据分析方法，如”CT法。总之，PCR实验需要严格的操作和细心的注意事项。始终遵循最佳实验规范，注意样本处理、试剂选择和实验设计等细节，以确保PCR实验的成功和准确性。加油吧，新手们！𐟒ꀀ

质粒构建全攻略：从零开始到成功转化 𐟎‰ 看着那些又大又圆的转化子，心情是不是特别美妙？质粒构建其实并不难，只要掌握了基本流程和技巧，你也能轻松搞定！下面我就来详细讲解一下质粒构建的整个过程。质粒构建的基本流程 𐟓œ 首先，我们需要准备好插入片段和载体。插入片段可以是gDNA、cDNA或者已有的质粒，只要上面有你需要的片段就行。然后，用PCR扩增出目标片段，回收这个片段。注意，PCR一般用pfu酶，如果扩增不好可以试试g或者保真较好的Taq。设计引物 𐟔犊设计引物时，需要在引物末端加入合适的酶切位点，这样可以让插入片段和载体进行连接。常见的酶切位点有Sacl、HindIII、EcoRI和KpnI等。你也可以采用同源臂的设计，让载体和插入片段通过同源重组进行连接。去磷酸化处理 𐟌Š 在利用单酶切位点或者同尾酶进行克隆连接时，为了防止载体自身环化，需要对载体进行去磷酸化处理。常用的碱性磷酸酶有Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)或者Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)。去磷酸化反应体系一般包括酶切胶回收后的载体DNA、10xSAP buffer、SAP酶和H2O，总体积20ul。大肠杆菌的转化 𐟦 在实验前，将金属浴或者恒温水箱调至42℃。然后从-80℃冰箱取出感受态细胞，于冰上化冻。接着将连接或者无缝克隆产物全部加入100ul感受态细胞中，用手指轻弹混匀，冰上静置15~20分钟。然后42℃热激90秒，迅速置于冰上2分钟。接着在超净台内向热激后的细菌中加入400-800ul不含抗性的LB培养液，置于恒温摇床内37℃200rpm恢复30~45分钟。离心后倒出大部分LB，留少许约100-150ulLB，在超净台吹匀沉淀菌体，将菌体悬液均匀涂布在含有对应抗性的LB平板上（取决于转化的质粒载体抗性，如Amp*或者Kan*）。将涂布后的平板倒置于37℃恒温培养箱内培养12-16小时。最后挑取6~10个菌落进行菌落PCR鉴定，或者直接进行液体培养，提取质粒后用酶切的方法鉴定阳性克隆。保存阳性菌 𐟧Š 将鉴定出来的阳性菌进行保存，于标记好的冻存管中，每管中加入30%甘油和300新鲜细菌培养液，充分混匀后置于-80℃保存。注意事项：①如果转化的是纯质粒（非连接或者重组产物），一定要降低使用量和感受态细胞使用量、及涂布细菌量。②-80℃保存菌液时，可以在提质粒时留一点备用。希望这篇攻略能帮到你，祝你早日构建出成功的质粒！𐟚€

分子克隆实验指南：从零开始到成功大家好！首先，非常感谢你们的关注和喜欢，真的很开心我的笔记能帮到大家。还记得最开始的那篇笔记，记录了我那次离谱的分子克隆实验，4个片段的同源重组竟然花了两个月！后来我慢慢发现，分子克隆其实非常微妙，有点像高中时的数学，学霸们轻而易举考100分，而我这种小学渣每次都在及格边缘反复横踩。所以，我想用这个账号记录我的科研日常，希望能和大家一起学习。之前的几篇笔记中，我分享过引物设计、载体酶切、同源重组等非常具体的实验方法。但最近我发现，很多粉丝朋友们刚开启自己的科研之旅，或者是偏向临床的科研大佬们，对分子克隆实验整体了解比较少。所以今天，我想跟大家分享一下质粒构建的大体流程。明确你的目标 𐟎斥…ˆ，在构建质粒之前，你需要有一个清晰的计划。明确你要使用哪种克隆方法，比如同源重组、TOPO克隆还是T4连接。TOPO/TA克隆不需要同源臂，而同源重组和T4连接是需要同源臂的。选择合适的载体 𐟚€ 根据你的实验目的，选择合适的表达载体。例如，常用的原核表达载体有pET28a，真核表达载体有pcDNA3.1，CRISPR/Cas9表达载体有Lenti-V2等等。载体可以通过酶切或者环形PCR后，跑胶回收所需的载体片段。设计引物并扩增片段 𐟔슦 𙦍€选的构建方法，设计并合成引物。PCR扩增需要插入的目的片段，PCR的产物也需要通过跑胶回收。连接与转化 𐟔„ 将载体和目的片段连接后，转入合适的感受态细胞内。例如，DH5˜“产生突变或者缺失，而Stable3相对更加稳定。但提质粒时需要使用试剂盒中的去蛋白液洗3遍，以充分去除核酸酶，减少后续对质粒酶切等实验的影响。通常连接产物的用量不超过总体积的1/20。然后在冰上静止20分钟，热激1分钟，再冰上静置3分钟，加入无抗的LB培养基，摇床摇40-60分钟，最后涂在合适抗性的LB平板上。培养与鉴定 𐟧ꊌB板子放在37度培养箱内过夜生长，第二天挑取单克隆细胞，置于合适抗性的LB培养基中摇菌，然后提质粒送测序公司测序。如果你想偷懒的话，也可以直接送菌液到公司哦，菌液和质粒的测序价格是一样的。今天就分享到这啦，希望这些内容对大家有用！如果有什么问题或者要补充的，欢迎评论或者私信哦！𐟘Š

目前的基因检测手段并不适用于万余年前的古人类相关基因分析。 ‌基因理论的局限性主要体现在以下几个方面‌：首先，基因工程只能生产自然界中存在的蛋白质。这意味着基因工程无法创造出自然界中不存在的全新蛋白质或已消亡的未知蛋白质，限制了其在创新及考古领域的应用‌。其次，基因技术涉及诸多伦理问题。例如，人的克隆技术引发了对人类本质和道德边界的深刻讨论，包括是否允许像对待外部自然界那样操纵和改变人类自身的自然体‌。此外，基因检测和应用也存在局限性。一些疾病与遗传因素的关系不明确，或者涉及的基因太多，难以建立疾病与基因关系的数学模型，这限制了基因检测在疾病预测和治疗中的应用‌。最后，基因理论本身也有其局限性。基因理论主要研究生物体的遗传和变异，但无法解释所有生物现象，且在某些情况下预测结果不如预期准确‌。基因扩增的技术局限性 ‌基因扩增技术的局限性主要包括以下几个方面‌： ‌技术难度较高‌：基因扩增技术对实验条件的要求非常高，包括特异性引物的设计和正确的PCR循环条件等。微小的环境变化都可能对实验结果产生显著影响，增加了实验的操作和维护难度‌。 ‌存在假阳性和假阴性问题‌：由于引物设计、合成质量、模板污染等原因，可能会导致非特异性扩增，从而产生假阳性和假阴性结果，这可能会误导医生的治疗决策‌。 ‌成本较高‌：多重PCR检测需要更多的试剂和设备，成本相对于单重PCR要高得多，这可能会增加医疗机构的负担，并可能影响其在基层医疗单位和欠发达地区的普及‌。 ‌对目标序列设计要求高‌：需要准确获取目标序列的信息，设计引物时需要特别注意其特异性和准确性，否则会影响扩增效果‌。 ‌无法对所有DNA序列进行全面检测‌：基因扩增技术存在一定的局限性，无法对所有DNA序列进行全面检测，特别是对于一些复杂的基因组结构，可能存在检测不到的区域‌。 ‌可能引发病情加重‌：在某些情况下，基因扩增可能会导致病情加重，例如在乳腺癌中，HER2基因的扩增可能预示着更差的预后，需要更积极的治疗‌。当前，由于基因扩增等技术条件的严重束缚，现阶段基因检测的基础水准就相当于人类早期天文学大发现的地心说阶段。因此在研究万余年前的基因样本时，存在着不可预知天量的检测误区，所得出的“令人满意”的结果可能于实际错综复杂的情况相差太远，甚至于正好相反，仅能做记录参考而已。基于目前的基因科技检测水平，万年前的历史问题应留待基因历史科学技术大发展后再研究，不宜过早下定论！

生物信息学干货：蛋白理化及多序列比对技巧 𐟓Š 蛋白质分子量与等电点预测不同蛋白质的等电点各异。当缓冲液与等电点一致时，蛋白质会沉淀，影响酶促反应。因此，了解蛋白质的等电点至关重要。BioXM软件可进行此分析。 𐟔 蛋白N端信号肽分析信号肽含有疏水区，可能导致重组蛋白形成包涵体。在设计引物前，需先进行信号肽分析，并在信号肽断裂位点后的碱基端设计引物。注意：切除信号肽后要验证读码框是否改变，且质粒载体上带有启动子，无需考虑RNA聚合酶转录问题。 𐟔„ 多序列比对 GeneDoc软件支持两种算法（pairwise和multiple）进行多序列比对，具体操作流程见图3。输出结果为aln格式，可用Jalview可视化打开。 𐟌𑠃lustalX2多序列比对将多条序列依次输入text文件，保存为txt格式。ClustalX2支持多种比对格式，完成后得到树文件和aln文件，用Jalview打开aln文件即可。 𐟌🠍EGA-X多序列比对及进化树分析 MEGA-X支持多序列比对和进化树分析，完成后输出fasta格式和mega格式文件。构建进化树后，可点击小锤子进行美化。 𐟎蠅Spript可视化及二级结构预测 ESpript可用于多序列比对可视化和二级结构预测。将MEGA比对后格式和Swiss model建模文件导入ESpript，即可生成高质量配图。 𐟔 Motif预测详细见图示，了解如何进行motif预测。

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