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bca法最新视觉报道_bbc黑白配(2024年12月全程跟踪)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：热点更新日期：2024-11-30

bca法

三种必备的蛋白质定量方法，你知道吗？ ### Bradford法 𐟒™ 原理：考马斯亮蓝蛋白定量法（Bradford法）是最常用的蛋白质快速定量方法之一。它的原理是这样的：在酸性条件下，考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue G-250）与蛋白质结合后，染料的最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色也从棕色变为蓝色。这个复合物的颜色深浅与蛋白浓度成正比，所以我们在595nm波长下测定吸光度值，就能计算出蛋白质含量啦！ BCA法 𐟒› 原理：Bicinchoninic acid (BCA)法是近年来广泛应用的蛋白定量方法。它的原理与Lowery法相似，都是在碱性环境下，蛋白质与Cu2+络合并将其还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值，并与蛋白质浓度成正比。这个方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性好，受干扰物质影响小，还不受去垢剂的影响。改良Lowry法 𐟒š 原理：在碱性条件和福林酚（Folin-Ciocalteu Reagent）存在下，铜离子与蛋白质形成可溶性蓝色复合物，在750nm有最大光吸收值。经典Lowry法的主要缺点是碱性铜试剂和蛋白颜色复合物不稳定。经过改良后，试剂配制简单且有非常好的稳定性和高灵敏度，测定步骤也更加简捷。这三种方法各有千秋，选择适合自己的才是最重要的！希望这些信息能帮到你，快去试试吧！𐟒ꀀ

BCA法蛋白浓度测定全攻略 𐟧꠨‰‚准备蛋白标品配置：取1mL标准品稀释液加入一支蛋白标品中，充分溶解后混匀，置于冰上待用。可分装后保存于-20℃，有效期三个月。注意：必须置于冰上，以防蛋白降解。 BCA工作液配置：将试剂一（BCA溶液）与试剂二（铜盐溶液）按50:1的体积比混合，现用现配。工作液可在2~8℃保存24小时。注意：精准计算待测孔所需工作液量，如测定4个蛋白样本，每个样本做3个复孔，共需7800⵬工作液，则A液：B液=7800:156。 𐟓 操作步骤样品孔处理：取20微升不同浓度的标准品加入对应的标准孔中，再加入20微升的待测样品。加入BCA工作液：向各孔中垂直悬空加入200微升的BCA工作液，轻轻混匀。震荡混匀：轻轻震荡20秒，确保混合均匀。反应：覆膜，37℃反应30分钟至一个小时，避光。测定吸光度：使用酶标仪在562nm波长下测定吸光度（OD值）。注意：试剂加入酶标孔中时，应触酶标板底，加样要慢，避免产生气泡，气泡会影响测定结果。绘制标准曲线：用标准品的吸光度作图。计算样品蛋白浓度：根据样品吸光度，利用标准曲线计算样品蛋白浓度。通过以上步骤，您可以使用BCA法准确测定蛋白质浓度，为后续实验提供可靠数据。

𐟧쨛‹白质检测的十大方法𐟔슰Ÿ”在生物研究领域，精确测定蛋白质浓度至关重要。下面为你揭秘十大常用的蛋白质测定方法！ 1️⃣ 电泳法：通过电泳技术分离蛋白质，根据条带位置和强度进行定量。 2️⃣ 比浊法：利用特定波长的光测量蛋白质溶液的浊度，从而推算浓度。 3️⃣ BCA法：通过与蛋白质结合的BCA试剂在特定波长下的吸光度来定量蛋白质。 4️⃣ Lowry法：利用蛋白质与某些试剂反应后的颜色变化进行定量。 5️⃣ 邻位连接技术：通过标记特定氨基酸的邻近氨基酸来定量蛋白质。 6️⃣ 蛋白芯片技术：利用微阵列技术，通过荧光或放射性标记来检测特定蛋白质。 7️⃣ 胶体金测定法：利用胶体金与蛋白质的结合进行定性或定量分析。 8️⃣ Bradford法：利用Bradford染料与蛋白质结合后的颜色变化进行定量。 9️⃣ 紫外光谱法：通过测量蛋白质在特定波长下的紫外吸收来定量。 𐟔Ÿ 凯氏定氮法：通过测定蛋白质中的氮含量来间接推算蛋白质浓度。选择最适合的方法，让你的蛋白质研究更上一层楼！𐟌Ÿ

WB实验秘籍！蛋白到SDS-PAGE 𐟓š 实验步骤概览蛋白提取选择和处理样本：首先，你需要了解目标蛋白的特性，这可以通过查阅已发表的文献或使用在线数据库如Uniport、NCBI和BIOGPS来实现。了解蛋白在哪些细胞或组织中表达，以及是否需要特定刺激来增加表达量。蛋白提取技巧：蛋白提取是WB实验的第一步，裂解液的选择、样本破碎方法、温度和变性条件都会影响蛋白提取的成功与否。整个过程需要在冰上进行，以减少高温引起的蛋白降解。如果是磷酸化蛋白检测，提取液中需要加入磷酸酶抑制剂混合物。蛋白浓度测定取少量裂解液进行蛋白质定量分析。常用的蛋白浓度测定方法有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法和胶体金法。目前，BCA法是最广泛使用的蛋白定量方法。其原理是在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。BCA试剂与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。制备SDS-PAGE凝胶 SDS-PAGE的目的是根据蛋白质的大小分离蛋白质。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子洗涤剂，当溶解时，它的分子在很宽的pH范围内形成净负电荷。将SDS添加到蛋白质中使蛋白质变性，并使其具有均匀分布的净负电荷。这就使蛋白质在电泳过程中向正极迁移。 PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）是丙烯酰胺单体的聚合物，当这种聚合物形成时，它会变成凝胶，用电将蛋白质拉过凝胶，就会根据蛋白的大小很好地将蛋白分开。凝胶由两种不同的凝胶层组成：上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。根据目标蛋白分子量大小、表达位置和样本数量确定分离胶和浓缩胶浓度、凝胶厚度和数量。通过以上步骤，你就能顺利进行WB实验，并得到准确的结果啦！𐟒ꀀ

内参不齐 Western Blot实验中，调整内参是关键的一步。以下是一些实用的技巧，帮助你快速且稳定地调整内参：选择合适的内参：可以查阅文献、遵循师门传统或通过通跑测试来选择合适的内参，例如GAPDH、Tublin或beta-actin等。 BCA法测定组织蛋白浓度：虽然有时候测完也不齐，但在测完的基础上调整更为方便。细胞铺板均匀：细胞不需要测BCA，但需要保证铺的板细胞均匀，这样上样量才能更准确。统一浓度上样：先统一浓度上样，再根据发光结果进行相应调整。浓的少加，淡的多加，这主要靠经验。确保电泳、转膜、封闭无误：在调整上样量之前，必须保证电泳、转膜和封闭没有问题，这样调整才能更准确。通过这些步骤，你可以更有效地调整内参，使Western Blot实验更加准确和可靠。

实验室小记：BCA和福林酚法实验心得大家好！最近在实验室里忙得不可开交，但我还是抽空来记录一下用BCA法和福林酚法测定蛋白和多酚的实验过程。希望对大家有帮助！𐟒ꊂCA法测蛋白含量试剂准备 BCA工作液：按照50:1的比例混合BCA试剂和Cus试剂，我一般会配6500：130的比例，这样可以点39个孔。蛋白标准品稀释：按照说明书操作，终浓度为0.5mg/ml。待测液浓度配置：因为标准品终浓度为0.5mg/ml，所以待测液也先选择这个浓度。如果后续测出来的OD值超过了标曲，可以再稀释。建议一开始配置时多设置几个浓度，这样误差会小一些。实验步骤加样：按照顺序（标准品稀释液→PBS→BCA工作液）在96孔板中加样。标准品浓度梯度为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，待测液可以同时加。反应：在37Ⰳ下反应15-30分钟，我一般反应最多20分钟，不然后面数值会越来越大。测吸光度：用酶标仪在A562nm处测吸光度，根据标曲计算出待测液中蛋白含量。福林酚法测多酚含量试剂准备没食子酸：稀释成一定浓度梯度（0、20％、40％、60％、80％、100％)。福林酚：10ml福林酚+90ml纯水。碳酸钠：7.5g碳酸钠→100ml。待测液：0.1mg/ml。实验步骤反应：将没食子酸稀释成一定浓度梯度，加入10％福林酚2.5ml，混匀反应3-8分钟，再加入7.5％碳酸钠2ml，混匀，室温放置6分钟。测吸光度：在A765nm下测吸光度，然后根据标曲计算待测液中的酚含量。小贴士这两个实验相对来说比较简单，但要注意加样的操作和标准品的配置要准确。每次反应的时间尽量保持一致，如果标曲不行需要重复做时。配置待测液时尽量多做几个浓度，方便后续对比选择。希望这些记录对大家有帮助！如果有任何问题，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

免疫共沉淀（Co-IP）实验全攻略 𐟔젥…疫共沉淀（Co-IP）简介：免疫共沉淀是一种利用抗体与抗原之间的特异性免疫反应来研究蛋白质间相互作用的方法。 𐟔 基本原理：在细胞裂解液中加入抗原特异性抗体，通过免疫沉淀反应形成免疫复合物。经过纯化、洗脱后，可以通过SDS-PAGE电泳、Western blot或质谱鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。 𐟌ˆ 优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。蛋白的相互作用在自然状态下进行，避免人为影响。可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 𐟚렧𜺧‚𙯼š 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用。两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能有第三者起桥梁作用。必须在实验前预测目的蛋白，选择检测抗体，若预测不正确，实验可能无结果。 𐟎›„：研究一种已知蛋白质与已知或未知蛋白质间的相互作用。 𐟛 实验步骤：用RIPA裂解缓冲液裂解细胞。用PBS配制50%的Protein A/G-agarose工作液。加入Protein A/G agarose工作液，4℃摇动10分钟去除非特异性蛋白。 4℃，14000g离心15分钟，去除Protein A/G-agarose微球。使用BCA法或其他方法测定总蛋白浓度。加入一抗，4℃过夜。 14000g离心收集沉淀，用预冷洗涤缓冲液洗涤3遍。收集上清，进行SDS-PAGE、Western blot或质谱分析。 𐟓š 总结： Co-IP是研究蛋白质相互作用的经典方法，虽然存在一些局限性，但通过精心设计和操作，可以获得可靠的实验结果。

WB实验内参跑得整齐的秘诀大家好，今天我来分享一些关于WB实验内参跑得整齐的小技巧，希望对你们有帮助！提总蛋白的小技巧 𐟧ꊥ†𐤸Š操作：提取总蛋白时，一定要在冰上操作。如果一次用不完的样本，记得保存到-80℃，避免蛋白降解。吸取干净：每次吸取样本时，吸得干净一些，减少干扰。准确蛋白定量 𐟓 通过BCA法确定每孔的上样量和体积，不要随意上样。控制煮蛋白的时间和温度 ⏲️ 将Buffer按计算量加入含有蛋白的EP管，煮蛋白时间不能过长，加热完成后及时插入冰中。选对凝胶及浓度 𐟧𔊦 𙦍†子量大小选择合适的凝胶和浓度。凝胶浓度越小，孔越大，较大的蛋白质更容易通过较大的孔。制胶及拔梳子时避免气泡。选择合适的膜 𐟕𘯸 常见的PVDF膜有0.2um和0.45um。较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。转印过程中的注意事项 𐟔„ 电泳及转膜过程中设置的参数要适合自己的分子量。 PVDF膜用甲醛激活前不可以沾水，保持干燥。做好标记，区分正反，避免转印错误。跑电泳时多跑一点，跑到目的蛋白胶下缘1cm左右，减少切胶失误。转膜时黑胶白膜，红对红黑对黑，提前预冷。一抗孵育 𐟦 将封闭好的PVDF膜置于塑料膜内，塑料膜做成小袋。将一抗用牛奶稀释。Actin：一抗：牛奶=1:2000；目的蛋白：一抗：牛奶=1:1000。 4℃摇床过夜。二抗孵育 𐟦 回收一抗。 TBST洗膜，三次，每次10min，摇床。二抗：牛奶=1:5000，与膜接触。摇床，室温，2小时。显影 𐟓𘊥›ž收二抗。洗膜，TBST三次，每次10min。显影液，A液：B液=1：1，避光。显影。

𐟔姧‘研笔记：内参整齐跑法攻略𐟓– 𐟧想要科研实验中内参跑得整齐又美观？这里有几个小技巧帮你轻松搞定！ 1️⃣ 提总蛋白是关键 𐟧Š操作时记得保持冰上环境，用不完的样本及时放入-80℃保存，避免蛋白降解哦。 2️⃣ 蛋白定量要准确 𐟔쩀š过BCA法确定每孔上样量，别凭经验随意来，这样内参才会更整齐。 3️⃣ 煮蛋白时间温度要控制 𐟔奊入适量Buffer，煮蛋白时间别太长，加热后迅速插入冰中，保持蛋白活性。 4️⃣ 选对凝胶及浓度 𐟧根据分子量大小选择合适的凝胶和浓度，让内参跑得更加均匀。 5️⃣ 膜的选择也很重要 𐟓–PVDF膜有0.2um和0.45um两种，选择合适的孔径，让内参更好地分离。 6️⃣ 转印过程需细心 𐟔„电泳及转膜参数要调好，膜要干燥且做好标记，避免转印出错。 7️⃣ 一抗孵育不可少 𐟐†封闭好的膜置于塑料袋内，用牛奶稀释一抗，4℃摇床过夜，让内参与抗体充分结合。 8️⃣ 二抗孵育也很关键 𐟐‰回收一抗后，用TBST洗膜三次，再用牛奶稀释二抗与膜接触，室温摇床2小时以上。 9️⃣ 显影环节不能少 𐟎奛ž收二抗后洗膜三次，用显影液A液：B液=1：1的比例混合后避光显影。 𐟒ᩁ𕥾꨿™些步骤，你的内参一定会跑得整齐又美观！加油哦！𐟌Ÿ

𐟒᥮ž验技巧揭秘：内参调整新方法 𐟔 跑WB时，内参不齐怎么办？别担心，有妙招！除了传统的BCA法，还有新方法哦！ 𐟌ˆ 方法一：根据颜色深浅来调整。如果发现内参颜色深浅不一，可以尝试稀释颜色深的样品，或者给颜色浅的孔补些样品，让内参更加整齐。但这种方法主观性较强，需要谨慎操作。 𐟌Ÿ 方法二：利用image J来分析。敷完内参后，用image J分析条带灰度值，根据结果调整上样量或样品稀释倍数，让内参更加均匀。 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚥悦žœ是细胞样品，接种时确保细胞量相同，干预结束后测细胞量并调平，这样后续跑WB会更准确哦！而且，选择合适的蛋白提取方法也很重要，比如超声破碎或磁珠破碎，这样得到的蛋白浓度会更高！ 𐟎‰ 现在，你掌握了调整内参的新技巧，快去试试吧！

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