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重叠pcr前沿信息_重叠pcr产物拖带(2024年11月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-11-28

重叠pcr

𐟧쨴觲’点突变实验全攻略✨ 在探索基因奥秘的旅途中，点突变技术可是个得力助手！𐟔 通过这种技术，我们可以精确地改变基因中的特定结构，比如酶活位点、修饰位点，来研究它们在蛋白功能中的关键作用。𐟒᠊ 今天，就让我们一起来学习两种实验室常用的点突变方法吧！𐟑颀𐟔슊1️⃣ 一步法快速定点突变（以质粒为模板）𐟒‰ 这种方法超级快捷，只需一步就能完成定点突变，是科研工作中的好帮手！ 2️⃣ 搭桥法（重叠延伸PCR技术）𐟌‰ 搭桥法通过巧妙地设计引物，能够精确地将多个突变点组合在一起，非常适合需要同时改变多个位点的实验。掌握这些方法，你就能轻松搞定基因定点突变实验啦！𐟎‰ 快来试试吧！

如何轻松实现无缝克隆？ 𐟔젤𘺤𚆥œ襅‹隆过程中减少突变的引入，推荐使用高保真PCR Mix进行扩增，并使用预线性化的质粒作为模板，这样可以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。 𐟓 引物设计原则： PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐18nt）序列，以确保扩增产物的5'端和3'端分别与相邻片段形成重叠序列。 𐟔砦’入片段的引物设计：正向扩增引物：5'—上游载体末端正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’ 反向扩增引物：3‘—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端反向同源序列—5’ 𐟔砨𝽤𝓤𘎦’入片段、插入片段与片段连接处引物、载体反向扩增引物的设计：最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数，即0.03 pmol（单片段、多片段适用）最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 㗠片段碱基对数（多片段）单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用5倍的用量多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时，直接使用10ng 若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50ng或高于200ng，建议按50ng或200ng用量使用线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。 𐟧ꠤ𝓧𓻥应：配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋。将反应体系置于50℃，反应5~60min。将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃。推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低。插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~15min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min。当载体骨架在10kb以上或插入片段总长在4kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min。建议在50℃反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。 -20℃储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

𐟧쳲-无缝克隆操作指南 𐟔젤𘺤𚆦升克隆效率并减少突变，推荐使用高保真PCR Mix来扩增DNA。同时，预线性化的质粒作为模板是更好的选择哦！ 𐟓 引物设计小技巧： - PCR引物的5'端，要包含与相邻片段同源的15-25nt序列，推荐18nt，确保扩增产物能与相邻片段形成重叠。 𐟓 插入片段的引物设计如下： - 正向扩增引物：5'端是上游载体末端的正向同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列。 - 反向扩增引物：3'端是基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端的反向同源序列。 𐟒ᠨ𝽤𝓤𘎦’入片段的用量建议： - 最适载体用量（ng）= 0.02 㗠载体碱基对数。 - 最适片段用量（ng）= 0.04 㗠片段碱基对数（单片段）；0.02 㗠片段碱基对数（多片段）。 - 若插入片段太长，则建议增加载体用量。 - 若插入片段太短，则建议增加片段用量至5倍。 𐟔堤𝓧𓻥应步骤来啦： 1️⃣ 轻轻混匀各组分，避免气泡产生。 2️⃣ 将反应体系置于50℃，反应5-60分钟。 3️⃣ 反应后置于冰上冷却，然后进行转化或储存于-20℃。 ⏰ 反应时间小贴士： - 插入1-2个片段时，推荐5-10分钟。 - 插入3-5个片段时，推荐15-30分钟。 - 当载体骨架或插入片段总长超过特定值时，建议延长至30-60分钟。 𐟒ᠦœ€后，记得在50℃反应后进行瞬时离心，确保反应液收集至管底哦！

合成生物学之DNA合成组装

circRNA如何调控LIG1转录表达？数据库分析筛选：通过FISH和核-细胞质RNA分离实验发现，circRNA主要分布在细胞核中。利用数据库（circAtlas2.0 database， ENCORI database; SPP database）分析发现，circRNA与LIG1启动子的结合蛋白有显著重叠，其中FOXA1是最显著的蛋白。进一步预测与FOXA1共同作用的蛋白，发现TET1与FOXA1结合。调控互作复合体验证：在GEM耐药株中，CoIP验证FOXA1和TET1相互作用；进一步沉默FOXA1和TET1后，LIG1表达降低，证实在耐药株中FOXA1/TET1复合体协同调控LIG1表达。进一步通过ChIRP和RIP实验证实circRNA能够与FOXA1和TET1蛋白结合。调控复合体功能：ChIP试验证实FOXA1和TET1结合在LIG1启动子的甲基化修饰区域，而circRNA的抑制降低了这种结合能力。MS-PCR实验显示，沉默circRNA或TET1增加了LIG1启动子的DNA甲基化水平，而过表达则相反。这些表明circRNA通过影响LIG1启动子甲基化水平，进而影响FOXA1/TET1复合体靶向结合LIG1启动子的能力。荧光素酶报告基因实验表明，沉默circRNA、FOXA1或TET1降低了LIG1启动子的转录活性，而过表达则增强了其转录活性。这些实验进一步表明circRNA/FOXA1/TET1对LIG1的促转录调控功能。结论：circRNA通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。 #chip实验#⠂ #coip#⠂ #科研#⠣研究生#

猫瘟那些事儿：你必须知道的事（1）最近在各种社交平台上看到不少关于猫瘟的求助信息，真是让人心疼。我家猫舍从来没有出现过猫瘟，但为了以防万一，我特意跟一些同行繁育人交流过，也跟合作的兽医学习了不少关于猫瘟的知识。希望这些信息对大家有帮助。猫瘟诊断的那些坑 𐟕𓯸 首先，很多人一看到猫咪活泼可爱，就以为没啥问题。结果去医院一检查，猫瘟试纸显示弱阳性，医院就开始猛操作，什么单抗、干扰素、营养药统统上。其实，猫瘟病毒（FPV）检测试纸的准确率并不高，普通的感冒也会导致阳性，误诊的可能性很大。唯一的好处就是速度快，15分钟就能出结果。如果试纸显示阳性，但猫咪没有明显的猫瘟症状（比如不吃不喝、水样血样便、高烧、血常规白细胞减少到危险值），正确的做法应该是隔离观察，并且立刻抽血做血常规和PCR检测。PCR是诊断猫瘟最准确的化验方式，但需要一天才能出结果。所以，除非猫咪有明显的急性症状（比如拒食、高烧、便血、白细胞低），医院不应该单靠一张猫瘟试纸就判断猫咪得了猫瘟。猫瘟试纸阳性但PCR正常？ 𐟤” 如果试纸显示阳性，但PCR正常，血常规也正常，基本上就是普通病毒感染。这种自限性疾病（即能自愈），没症状的就隔离观察，加强营养补充；有症状的按照症状治疗。病毒性感冒和猫瘟的治疗用药有很大一部分是重叠的，都是肠胃保护药、抗生素、干扰素和营养补充。这也是为什么很多医院会把病毒性感冒也说成是猫瘟，反正治疗手段都差不多。住院治疗和隔离 𐟏劊猫瘟是非常严重的恶性传染病，所以必须隔离治疗。隔离的意思不是单独一个笼子，而是至少单独一个房间。如果一个医院把猫瘟的猫跟得了其他病的猫放在同一个病区住院，那么要么是这个医院在忽悠，要么就是没有最基本的传染病预防素养。结语 𐟓 养猫之前多跟猫舍和同城猫友交流，记下几个靠谱的宠物医生，有备无患总是好的。希望这些信息能帮到大家，让我们的猫咪都能健康成长！字数有限，先写这么多，关于猫瘟潜伏期、家庭消毒还有猫瘟治疗的部分，我会再开一篇笔记补充。

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