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荧光素酶报告实验新上映_荧光素酶报告实验结果分析(2024年12月抢先看)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

荧光素酶报告实验

萤（荧）光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Fireﬂy)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。在荧光素酶的催化下，荧光素底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光实验原理：荧光素酶报告基因检测的原理‌是通过检测荧光素酶的活性来反映基因表达的情况，将荧光素酶基因与目的基因或其调控元件（如启动子、增强子、3’UTR等）连接在一起，构建成报告基因载体，转染或转化到目标细胞或生物中。当目的基因或其调控元件受到内外因素的影响而发生表达变化时，相应地也会影响荧光素酶基因的表达水平，通过向样品中加入特定的底物，使荧光素酶催化底物氧化发出生物荧光，并利用专用仪器（如发光仪、微孔板读板仪等）检测荧光信号的强度，从而反映目的基因或其调控元件的活性。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法 #汉恒生物##科研##荧光素酶基因检测##荧光素酶#

揭示circRNA编码肽在TNBC中的分子机制 circCAPG通常与miRNA、蛋白质相互作用。为了探索circCAPG是否通过与miRNA相互作用来抑制TNBC的进展，进行anti-AGO2（RIP）实验，结果显示下拉物中没有circCAPG富集（图1）。 circRNADb数据库预测和双荧光素酶基因报告实验显示circCAPG可能编码一个171个氨基酸的蛋白质。分别对突变体circCAPG-FLAG/-FLAG-IRES-mut/-FLAG-ATG-mut进行IP实验，下拉物Western blot显示，只有circCAPG-FLAG可以翻译成一个名为CAPG-171aa的多肽(图1D和E)。为了解CAPG-171aa调控TNBC进展的潜在分子机制，对CAPG-171aa进行IP实验，质谱检测其潜在的互作蛋白分子（图2A）。在大量的互作蛋白中，最终挑选9个蛋白进行IP-WB验证，且只有STK38能与TNBC细胞中的CAPG-171aa结合(图2B)。此外，STK38与母体CAPG无相互作用(图2C)。既往研究表明，STK38可以调节MYC蛋白的稳定性，并通过与SMURF1结合，促进MEKK2的泛素化和降解。通过使用anti-MEKK2进行IP分析，发现MEKK2可与STK38和SMURF1相互作用(图3A)。进一步anti-SMURF1 IP分析研究证明，OE-CAPG-171aa能降低STK38和SMURF1之间的相互作用(图3B)。此外，anti-MEKK2 IP分析还发现OE-CAPG-171aa降低MEKK2的泛素化，增加MEKK2蛋白水平(图3C)。相应的，MEKK2的泛素信号在circCAPG敲减的TNBC细胞株中增加(图3D)。后续功能回复实验，MEKK2 KD可以降低CAPG-171aa-OE TNBC细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭能力，表明MEKK2是CAPG-171aa的下游伴侣。全文分享可查阅：【《Molecular Cancer》文献解读：利用IP/RIP技术揭示circRNA编码肽在TNBC中的分子机制】。 #科研#⠂ #分子机制#⠂ #RIP实验#⠣研究生日常#⠣文献阅读#

𐟌Ÿ双荧光素酶报告系统必备资源库𐟌Ÿ 在双荧光素酶报告系统的研究中，以下四个资源库网站是科研人员的好帮手，赶紧收藏吧！ Promega 𐟏𗯸：这家公司提供多种荧光素酶底物和试剂盒，满足双荧光素酶报告实验的各种需求。 Addgene 𐟏𗯸：这是一个非营利性的生物资源库，提供质粒和表达载体，包括荧光素酶相关的质粒，方便研究人员进行基因转染和表达。 NCBI 𐟏𗯸：美国国家生物技术信息中心提供了多个数据库，如PubMed、GenBank、Gene等，可以搜索和获取与双荧光素酶报告系统相关的文献、基因序列和蛋白质信息。 PubChem 𐟏𗯸：这是NCBI的化学物质数据库，提供大量的化合物信息和生物活性数据，有助于荧光素酶底物的筛选和选择。这些资源库网站在双荧光素酶报告实验中发挥着重要作用，大家在平时的实验中是否都使用过呢？如果需要更多帮助，可以考虑使用这些资源库网站哦！

circRNA如何调控LIG1转录表达？数据库分析筛选：通过FISH和核-细胞质RNA分离实验发现，circRNA主要分布在细胞核中。利用数据库（circAtlas2.0 database， ENCORI database; SPP database）分析发现，circRNA与LIG1启动子的结合蛋白有显著重叠，其中FOXA1是最显著的蛋白。进一步预测与FOXA1共同作用的蛋白，发现TET1与FOXA1结合。调控互作复合体验证：在GEM耐药株中，CoIP验证FOXA1和TET1相互作用；进一步沉默FOXA1和TET1后，LIG1表达降低，证实在耐药株中FOXA1/TET1复合体协同调控LIG1表达。进一步通过ChIRP和RIP实验证实circRNA能够与FOXA1和TET1蛋白结合。调控复合体功能：ChIP试验证实FOXA1和TET1结合在LIG1启动子的甲基化修饰区域，而circRNA的抑制降低了这种结合能力。MS-PCR实验显示，沉默circRNA或TET1增加了LIG1启动子的DNA甲基化水平，而过表达则相反。这些表明circRNA通过影响LIG1启动子甲基化水平，进而影响FOXA1/TET1复合体靶向结合LIG1启动子的能力。荧光素酶报告基因实验表明，沉默circRNA、FOXA1或TET1降低了LIG1启动子的转录活性，而过表达则增强了其转录活性。这些实验进一步表明circRNA/FOXA1/TET1对LIG1的促转录调控功能。结论：circRNA通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。 #chip实验#⠂ #coip#⠂ #科研#⠣研究生#

为什么发表SCI论文需要这么长时间？发表一篇SCI论文的过程之所以漫长，主要是因为不同分区的SCI期刊对科研工作量的要求差异巨大。𐟌 𐟔 一、二区SCI期刊的影响因子通常在5分以上，对论文的要求非常高。它们不仅需要高水平的研究成果，还要求论文具有较高的创新性和严谨的论证。实验设计、数据分析和结论论证都需要经过严格的审查，这无疑增加了实验成本。 𐟔젧›𘦯”之下，三、四区SCI期刊的影响因子多在0-3分之间，对文章的要求相对较低。它们对研究创新性和影响因子的要求没有那么严格，使得发表过程相对容易一些。 𐟔�‘表一区、二区的高分SCI论文，科研团队需要对文章的科学问题进行深入的研究。文章的内容需要具有创新性，涉及新的研究技术或新的交互关系。为了验证这些科学假说，科研团队需要进行大量的探究性实验，利用生物信息学、临床研究、分子生物学、细胞生物学以及动物模型等多维度进行探究和验证。 𐟓Š 一区、二区期刊的SCI论文往往涉及复杂的交互因子，需要对科学假设进行不少于4组的因果逻辑论证。最终的结果需要通过至少5个组图在论文中进行呈现。例如，在细胞水平探究某lncRNA调控某蛋白的转录活性和表达时，一张figure可能就涉及多个细胞株、过表达和（或）敲减细胞或不同处理条件下的荧光素酶报告实验、RT-qPCR、WB实验的多次实验和不同方法所得结果，工作量大大增加。总之，发表SCI论文需要经过严格的审查和大量的实验验证，这使得整个过程显得格外漫长。𐟕𐯸

双荧光素酶试验常见问题及解决方法在进行双荧光素酶试验时，由于多种因素的影响，如载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度和检测过程等，实验结果可能会出现偏差。以下是一些常见的实验问题及其解决方法： 𐟌ˆ 荧光值过高当荧光值过高时，可能会超出仪器的检测范围，导致无法检测到值。一般建议将荧光值控制在5-6位之间。以下是解决方法：减少质粒转染量；细胞样品裂解后，离心取上清液进行检测，或对裂解产物进行稀释后检测。注意：不建议通过减少底物量来降低荧光值，因为这会影响荧光素酶的真实表达水平，导致检测结果偏差。 𐟌‘ 荧光值过低或无荧光值荧光素酶的表达水平与启动子活性相关。正常情况下，检测到的荧光值应在105数量级左右。如果荧光值过低或无荧光值，可以从以下几个方面进行排查：转染效率低优化转染实验条件，使用较易转染的质粒作为阳性对照；确保转染DNA的质量，可以通过酶切或琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；选择活性较高、处于指数分裂期的细胞进行转染。启动子活性低或诱导失败转染后的细胞培养使用特异性诱导启动子的条件；优化细胞培养条件，提高荧光素酶的表达量；更换强启动子（如SV40、CMV）。 𐟓Š 复孔重复性差报告基因检测实验受多种因素影响，同批次样品检测值可能出现浮动。除了引入另一个报告基因作为内参照外，一般需要设置3个或3个以上复孔。以下是减小复孔差异的方法：细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准。通过这些方法，可以尽可能减小复孔之间的差异性，得到更准确的结果。

生物发光与荧光成像的3个关键技巧 ### 选择合适的报告子 𐟌 在进行生物发光成像（BLI）时，选择合适的报告子至关重要。常用的生物发光报告子如荧光素酶，在细胞靶点表达时，能提供优越的光学信噪比（SNR）数据。这种方法特别适合单一细胞靶点的研究。而在荧光成像（FLI）中，虽然荧光报告子的SNR较低，但它们在整个光谱（从大约360nm到1000nm）上具有不同的Ex/Em光谱。这使得FLI实验能够实现多通道、多标记。FLI方法得到了商业化试剂盒的支持，可用于标记小分子、抗体和细胞。特别推荐使用近红外区（NIR，690nm至1000nm）的荧光报告子，因为它们波长较长，与组织的相互作用最小，光吸收率较低，具有优越的组织穿透性（>1cm）和相对较好的SNR。荧光报告子也非常适合于针对主要器官的生物分布进行灵敏的体外评估。减少动物毛发和皮肤的干扰 𐟐𞊊深色的动物毛发和皮肤色素会吸收和散射入射光和发射光。因此，尽可能使用无毛、白化或Hr突变的动物品系。如果由于动物模型的遗传背景或免疫能力状况不允许，可以在成像前进行脱毛处理，比如使用剃毛器或脱毛膏，完成后清洗干净处理部位。最好在成像前24小时进行剃毛或脱毛，因为脱毛过程可能引起轻度的皮肤炎症，会影响靶向炎症探针的生物分布和/或活性。给动物喂食无自发荧光的饮食 𐟍€ 在FLI中，如果动物的饮食中含有富含叶绿素的植物苜蓿，动物肠道就会产生NIR自发荧光。为了避免基于叶绿素的自发荧光（在大约700nm处），建议至少在成像前一周开始给动物喂食不含苜蓿的饮食。通过这些小技巧，你可以更有效地进行生物发光和荧光成像实验，获得更准确的数据。

小动物活体成像技术：关键因素与常见问题在进行小动物活体成像时，有几个关键因素会影响成像效果，包括给药方式、荧光标记物的波长和动物毛发。以下是这些因素的详细说明及注意事项：给药方式 𐟒‰ 腹腔注射：这种方法可以使底物迅速分布到全身，并能够穿过包括大脑在内的血液组织屏障。注射后10~20分钟，发光信号达到峰值，60分钟内逐渐减少至不可检测。尾静脉注射：这种方式可以提供更好的再现性和5~10倍的高信号，但注射难度较高，代谢速度快。建议在进行荧光素酶底物成像或更换新品牌底物时，先进行预实验，确定最佳延迟时间。荧光标记物波长 𐟌ˆ 自发荧光：大多数生物体内都表现出一种天然的荧光，称为自发荧光。这些荧光与标记物发射波长重叠，经激发光照射会发射出与标记物相似的荧光波长，导致低信噪比，检测灵敏度受限。例如，GFP的最大激发波长是488 nm，最大发射波长是507 nm，与皮肤及毛发中的胶原蛋白和弹性蛋白等成分的发射波长相近，有较高的背景信号。波长选择：建议使用近红外波长的荧光染料，优点是更高信噪比，穿透更深，或使用iRFP作为报告基因，该荧光蛋白具有更高的亮度、光稳定性和信噪比。动物毛发 𐟐튦‘生长周期：C57BL/6小鼠的毛发生长周期由三个阶段组成：静止期（皮肤为淡粉色）、生长期（皮肤变为深灰色或黑色）、成熟期（毛发停止生长，皮肤恢复为淡粉色）。生长期中的皮肤色素沉着是活体成像中的一个重要变量，特别是当需要对小信号变化或动物之间的差异敏感时。强烈着色的皮肤可导致90%以上的光信号衰减，这显然会导致显著的实验误差。剃毛或化学脱毛：建议成像前一天，通过剃毛或化学脱毛来去除观察区域的毛发，以便最大限度地收集信号。通过注意这些关键因素，可以优化小动物活体成像的效果，减少实验误差，提高数据准确性。

一文详解microRNA：从基础到前沿今天下午，2024年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，颁给了美国科学家Victor Ambros和Gary Ruvkun，以表彰他们在发现微小RNA（microRNA）及其在基因调控中的作用方面做出的开创性贡献。借着这个机会，我们来详细聊聊microRNA。什么是microRNA？𐟤” microRNA是一组由基因组编码的非编码RNA，长度大约在20-23个核苷酸之间。它们通过与靶基因mRNA的碱基配对，引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译，从而精确地调节基因表达的强度和时间。 microRNA的生物合成过程𐟔슭icroRNA的生物合成过程相当复杂。首先，RNA聚合酶II转录出包含茎环结构的初级转录本（pri-miRNAs），少数pri-miRNAs是由RNA聚合酶III转录的。接着，pri-miRNAs在细胞核内被Ⅲ型核酸内切酶Drosha和辅助因子DGCR8蛋白识别，并在距离pri-miRNA茎环结构分界点约11个碱基处被剪切，形成miRNA前体（pre-miRNAs）。pre-miRNAs通过核孔到细胞质后，在多种蛋白和Ⅲ型核酸内切酶Dicer的作用下形成miRNA双链。最后，miRNA双链与包括Argonaute蛋白的蛋白质复合体结合，形成靶向mRNA的沉默复合体RISC，又称为miRNP。在这个过程中，5′-端碱基配对稳定性较差的链被保留，形成成熟的miRNA，另一条链则会被迅速降解。 microRNA的生物学功能𐟌𑊩š着对microRNA的深入研究，已经在植物、动物和病毒中发现超过20000个microRNA。这些microRNA介导的基因调控在细胞分化、对环境的适应性、人类发育、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生以及宿主细胞与病原体的相互作用中发挥关键作用。 microRNA的基础研究思路𐟧 确定研究某种表型中的microRNA：一般来源于测序或者文献调研。建议从microRNA的测序开始研究。明确microRNA在某种感兴趣的表型中的靶基因：预测靶基因一般涉及到Targetscan、miRDB、PicTar等软件预测靶基因3’UTR与microRNA的结合位点。预测到的靶基因成千上万，因此还需要查阅相关文献，进一步确定miRNA和靶基因的靶向关系，这样能够极大程度地增加实验的成功概率。通过实验验证microRNA和靶基因的靶向关系：构建靶基因3’UTR与含有microRNA的结合位点的双荧光素酶报告系统重组质粒，再转染检测荧光值确定靶向关系。通过这些步骤，我们可以更深入地了解microRNA的功能和作用机制，为未来的研究和应用打下基础。

双荧光素酶互补实验：生物分子互动的全新视界

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