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pcr原理前沿信息_pcr原理和三个主要步骤(2024年11月实时热点)

内容来源：卡姆驱动平台所属栏目：教程更新日期：2024-11-26

pcr原理

qPCR原理详解：实时荧光定量PCR 大家好，今天我们来聊聊qPCR（定量多聚酶链式反应）的原理。最近有点抑郁，加上药物作用，每天睡12小时，实在没精力更新。不过还是感谢大家的支持，下周有流式实验，到时候会拍操作界面的照片给大家详细讲解。 qPCR和传统PCR的主要区别在于检测方式。传统PCR只是对基因进行扩增，而qPCR则是实时检测底物的荧光强度来判断mRNA的表达量。这就引入了一个重要的概念：Ct值。在qPCR中，基因的表达与荧光强度并不是线性关系，而是指数级增长（因为DNA的扩增是2^n次方）。因此，在某个循环时，荧光强度会达到一个阈值。当荧光强度超过这个阈值时，我们认为是高表达。到达这个阈值需要的循环数越少，基因的表达量就越高。这就是图2中曲线含义的解释（图片来源：Merck）。有人可能会问，既然是mRNA的表达量，为什么说是DNA的扩增呢？这就要提到mRNA和cDNA的概念。空气中存在RNA酶，所以RNA在正常条件下极不稳定。即使是RNA-seq，也需要将RNA逆转录为cDNA。在生物学中，我们一般认为这两者的表达是一致的。篇幅有限，下次再讲操作流程（RNA提取和引物设计等）。感谢大家的支持。

circRNA实验全解 𐟔 实验原理在组织或细胞中提取的total RNA通常包含多种RNA。为了准确分析circRNA，首先需要去除样本中的核糖体RNA和poly-A RNA干扰，然后用RNase酶消化掉线性RNA，从而使circRNA富集。 𐟓Š 实验目的从总RNA中富集circRNA，采用Northern blot和特异的PCR进行验证，并对circRNA的成环特性进行评估。 𐟧ꠥꌦ料 RNA提取试剂盒核糖体RNA去除试剂盒 PolyA结合磁珠 RNAaseR试剂盒放线菌素D Northern blot试剂盒发散引物RT-PCR 𐟓 实验步骤 4.1 RNA提取样品处理组织样品：加入400ul Trizol溶液到装有绿豆大小组织块的EP管中，利用电动组织匀浆器在冰上充分匀浆1-2min，后放置室温充分裂解10min。细胞样品：12孔板细胞弃去上清，每孔加入600ul Trizol溶液。先在冰上裂解15-20min，再用1ml移液枪吹打液体充分裂解贴壁细胞，后将液体转移到RNasefree EP管中。 RNA提取按1:5比例，在Trizol溶液中加入氯仿，手动充分摇匀混合液20-30s，室温放置10min。 4度1200g离心10min，小心转移上层透明液体到EP管中。按异丙醇与Trizol溶液比例为1:2加入异丙醇，上下颠倒混匀液体，室温放置10-15min。 4度1200g离心10min，弃去上清，可见羽毛状RNA沉淀于管侧底部。按等比例加入75%乙醇，温和地悬浮RNA沉淀。 4度7500g离心5min，尽量吸除上清，室温晾干5-10min。用20ul RNase free dH20溶解RNA，测浓度后-80度保存。总RNA定量 RNA在260nm波长处有最大吸收峰，可通过测定RNA样品的OD260和OD280估算出RNA的含量和纯度。OD260值为1相当于40ug/ml单链RNA，该方法提取的RNA OD260/280值在0.8-2之间。 circRNA的预处理去除核糖体RNA和poly-A RNA 使用Invitrogen的核糖体RNA去除试剂盒RiboMinusTM Human/Mouse Transcriptome Isolation Kit（货号K1550-01）。通过磁珠法结合Poly(A)的RNA后剩余的RNA即为Poly(A)-RNA样品。 RNAaseR酶消化 RNase R是一类核糖核酸外切酶，能降解大部分线性RNA，但circRNA不易被RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别circRNA和线性RNA。准备总RNA样品：提取细胞或组织的总RNA，测浓度后备用。 RNaseR反应体系：取5ug total RNA样品按下面体系准备消化。短暂旋转试管，添加5xFirst-StrandBuffer, 0.1MDTT, RNasin和SuperScriptM RT，轻轻移液并将反应液在25℃下孵育5分钟。在50℃下孵育60分钟，然后通过灭活反应在70℃加热15分钟。发散引物可以扩增circRNA，而不能扩增线性RNA。 𐟓š 参考文献 Chen et al. (2015). Isolation of non-polyadenylated and ribosomal-free RNAs from mammalian cells. Methods Mol Biol 1206, 69-80. Yang et al. (2016). Characterization of Circular RNA. Methods Mol Biol 1402, 215-227.

𐟔쐃R实验的神奇原理𐟧슰Ÿ”婫˜温变性：首先，DNA模板经过加热至95Ⱕ𗦥𓯼Œ在短短的30秒内，DNA双链就会解开，为接下来的反应做好准备。 𐟌᯸低温退火：温度逐渐降低到58Ⱕ𗦥𓯼Œ这时引物就派上用场了。引物，就像是小磁铁，它们能够找到并与DNA单链上的互补序列配对结合。这个过程就像是寻找和锁定目标一样，非常精准且高效。 𐟒ꦁ’温延伸：在Taq酶的催化下，以dNTP为原料，DNA模板和引物结合物开始复制新的DNA链。这个过程中，每一步都按照碱基配对和半保留复制的原理进行，就像是在制造DNA的复制品。 𐟔„循环往复：重复上述三个步骤，变性、退火、延伸，每一次循环都能产生更多的DNA复制链。而且，这些新链还可以作为下一次循环的模板，使得DNA的扩增速度呈指数级增长。 𐟎‰结果：经过2-3小时的反应，原本微量的DNA就能被扩增放大几百万倍，从而为我们提供足够的DNA来进行后续的分析和研究。这就是PCR实验的神奇之处！

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PCR技术全解析：从原理到操作细节 PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外快速、大量复制特定DNA片段的技术，其基本原理模拟了细胞内的DNA半保留复制过程。DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。 PCR核心步骤变性 PCR循环开始时，将含有模板DNA的反应体系加热至90-96℃（通常为94℃），使DNA双螺旋结构解旋成两条单链，以便后续引物结合。退火随后降温至45-65℃（典型值为50-60℃或针对特定引物优化的温度），在这个阶段，设计好的一对寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列结合。延伸最后，在72-75℃条件下（通常为72℃），热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）从引物的3'端开始合成新的DNA互补链，沿模板方向进行延伸，生成新的双链DNA分子。每个循环结束后，新生成的DNA分子又可以作为下一轮循环的模板，从而实现指数级别的扩增。操作细节试剂准备：包括模板DNA、一对特异性引物、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）、缓冲液、Taq DNA聚合酶以及灭菌去离子水等。体系配制：按照一定的比例将上述成分混合到一个离心管中，形成PCR反应体系。程序设置：根据PCR仪的使用说明，设定好不同的温度和相应保持时间，例如94℃变性、55℃退火（对于具体引物可能不同）、72℃延伸，并重复这些循环数次（通常30-40次）。扩增后处理：扩增完成后，可进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，或者进一步纯化以用于后续分析。注意事项无菌操作：PCR实验对污染极其敏感，所有实验材料及操作环境应严格无菌，避免外来DNA污染。准确量取：PCR反应体系中的各组分用量要精确，尤其是引物和模板DNA的浓度直接影响PCR效率和特异性。引物设计：引物的设计至关重要，需保证特异性和适当的熔解温度（Tm值）。防止气溶胶污染：加样、开盖操作应在超净工作台内完成，尽量减少气溶胶扩散的可能性。仪器校准：确保PCR仪温控准确，过高的变性温度可能导致DNA降解，过低的退火温度或延长的时间则可能导致非特异性扩增。结果验证：通过电泳检测扩增效果，并确认条带大小与预期目标一致，必要时可通过测序验证PCR产物的准确性。

分子克隆全攻略：从原理到操作分子克隆是生物学研究中的一项关键技术，主要用于分离、纯化和扩增特定的DNA片段。以下是分子克隆的主要步骤和原理：质粒提取 𐟌 碱裂解法：利用共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5的条件下，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，而共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。 PCR 𐟔슨š合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：目的是在体外扩增特定的DNA条带。高温变性（Denaturation）：双链DNA在高温下变性，双链打开变成单链。低温退火（Annealing）：引物与模板DNA互补区结合。适温延伸（Extension）：模板DNA-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则和半保留复制原理，引物沿着5'→3'的方向合成新的DNA链。 PCR产物纯化/胶回收 𐟧𜊧滥🃦Ÿ𑦳•：大多数离心柱中吸附DNA的是一层硅胶膜，实际上就是一层玻璃纤维，其表面有大量修饰的硅羟基（Si-OH），硅羟基在溶液中解离后带负电，然后与带正电盐离子、带负电DNA形成电桥，从而吸附住DNA，使得DNA双链变单链，不会被生物大分子溶剂洗脱，但能经水溶性缓冲液水化后，被定量回收，从而实现纯化分离。转化 𐟦 感受态细胞：指细菌在一定的生长阶段，能够吸收外来DNA的状态。转化是指将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。原理：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。菌落PCR 𐟏𚊥ŽŸ理：这是一种用单个菌作为模板的鉴定方法，可以快速检测菌落是否为含目的质粒。希望这些信息能帮助你更好地理解分子克隆的原理和操作步骤，祝你在科研道路上顺利前行！

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

无缝克隆：传统酶切连接的革命无缝克隆是一种基于dsDNA黏性末端互补配对的克隆技术，它利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键来修复缺口。与传统的酶切连接不同，无缝克隆不使用内切酶来制造黏性末端，而是利用T5核酸外切酶来产生黏性末端。无缝克隆的原理如图2所示。假设我们需要将三个片段按照1→2→3的顺序拼接起来，只需确保1的末尾和2的开头，以及2的末尾和3的开头具有相同的序列（即同源臂）。这些同源序列可以通过PCR方法在目的片段上加上。无缝克隆的另一个关键点是利用高温。T5外切酶的最适温度是37℃，但无缝克隆在50℃下进行，且酶单位较少，因此整个反应体系很快便会失去外切活性，而DNA聚合酶的活性得以维持。为了保证DNA连接反应顺利进行，无缝克隆采用热稳定的Taq DNA连接酶。同时，为了保证黏性末端能够在50℃下进行互补配对，同源臂的长度一般>15 bp。无缝克隆的优势主要体现在以下几个方面：不受片段序列的限制：无缝克隆不依赖于限制性内切酶，仅靠同源臂进行互补配对。因此每次进行片段拼接时，仅需通过引物制作同源臂，而不需要像以往一般仔细地检查PCR出来的外源片段内部是否同时会被内切酶消化，也不再需要购买各式各样的酶。多片段拼接：传统的酶切克隆由于酶切位点有限，能组装的片段数量有限。同时，由于酶切位点之间存在着一定的空间距离，片段与片段之间不可避免地会产生间隔“缝隙”。此外，酶切克隆通常一次只能拼接2-3个片段。随着拼接片段的增多，传统方案的效率会急剧降低，通常只能分多次拼接。而无缝克隆可轻松拼接4-5个片段，最高可达10个，而且只需要将所有片段混在一个管子里反应。节省时间：与传统的酶切克隆操作相比，无缝克隆仅需PCR和胶回收，随后即可直接进行多片段拼接。拼接10个片段所花的时间，跟拼接2个片段的几乎是一样短的。无缝克隆技术的应用将大大提高分子生物学实验的效率和准确性，是现代生物技术中的重要工具。

qPCR实验步骤详解：从原理到操作 𐟔젱PCR 扩增原理 qPCR，即定量PCR，是一种在PCR反应中引入荧光染料或探针的方法。通过实时监测荧光信号在整个PCR过程中的累积，最终利用CT值和标准曲线对未知样本进行定量分析。这种技术的高灵敏度、高效率和高精确性，使其在生物医学领域的基因表达分析、病原体检测以及基因定量研究中得到广泛应用。 𐟌ˆ 常用标记方法 SYBR Green：这是一种非特异性荧光标记方法。SYBR Green I是一种荧光染料，能与所有双链DNA结合。因此，荧光信号量与反应体系中的双链DNA含量成正比，荧光强度随产物增加而增加。但值得注意的是，由于染料与双链DNA结合具有非特异性，可能导致假阳性结果。优点：简单易行，成本较低，无需合成特异性探针。缺点：对扩增的特异性要求高，不能进行多重PCR。 TaqMan技术：这是一种特异性荧光探针方法。在PCR扩增过程中，除了引物外还会加入一种特异性的荧光探针。这种探针由寡核苷酸构成，5端标记有一个荧光报告基团（如FAM等），3端标记有一个淬灭基团（如TAMRA等）。探针完整时，5端的荧光基团发出的荧光会被3端的淬灭基团淬灭，导致不能发出荧光信号。但在PCR扩增过程中（尤其是在延伸阶段），Taq酶的5'→3'外切酶活性会降解探针，使报告基团和淬灭基团分离，从而使得5端荧光物质释放出来，并产生荧光信号。优点：特异性强，能进行多重PCR。缺点：需要设计特异性探针，成本较高；有时探针设计困难。 𐟧ꠤ𚧧‰饤„理步骤待仪器扩增完成且冷却后，打开仪器舱门或滑开盖子。结果分析完成后，才取出扩增产物。如果需要立即进行下一个实验，应检查本次实验结果是否存在异常曲线。若发现异常曲线，需要观察异常曲线位置以及相应反应管中扩增物的状态，初步排查可能的原因，如试剂蒸发或分液不均等。取出产物时需要检查是否有反应管爆裂或松动，应该尽量捏住反应管壁而非管盖，以防在取出过程中管盖脱落。避免随意丢弃扩增产物，应先将其装入密封袋中，再丢入指定的垃圾桶。

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